L'uso di AAA-ATPasi per rimuovere le proteine da un doppio strato lipidico è un tema comune nel controllo della qualità delle proteine. Una comprensione meccanicistica di questo processo essenziale richiede un sistema ricostituito. La precedente ricostituzione con AAA-ATPasi era complessa ed eterogenea.
Il nostro sistema è semplice e completamente definito. Questo ci permette di manipolare l'AAA-ATPasi Msp1, il substrato e l'ambiente lipidico. Per iniziare, aggiungere tampone di ricostituzione precedentemente preparato, proteine Msp1 e TA purificate e liposomi in un tubo PCR, quindi incubare la miscela su ghiaccio per 10 minuti.
Durante l'incubazione, tagliare la punta di una punta della pipetta P200 a circa 1/8 di pollice di diametro. Quindi, ruotare accuratamente il tubo contenente BioBeads per ottenere una miscela uniforme. Quindi, rimuovere rapidamente il coperchio e utilizzare la punta della pipetta P200 tagliata per trasferire un volume appropriato delle perline in un tubo PCR vuoto.
Una volta completata l'incubazione di 10 minuti per la ricostituzione, utilizzando una punta della pipetta non tagliata, rimuovere tutto il liquido dalle BioBeads. Quindi, trasferire 100 microlitri della ricostituzione nel tubo con le BioBeads e lasciarlo ruotare su una ruota per 16 ore. Il giorno seguente, ruotare il tubo in un PicoFuge per pellettare le perline, quindi trasferire il materiale ricostituito in un tubo PCR pulito e mantenere il tubo sul ghiaccio.
Per rimuovere le proteine che non sono riuscite a ricostituirsi nei liposomi, equilibrare le colonne di spin del glutatione con il tampone di estrazione, che in genere comporta tre cicli di lavaggio con 400 microlitri di tampone, seguiti da centrifugazione per rimuovere il tampone. Quindi, aggiungere cinque micromoli di ciascun chaperone al materiale ricostituito, seguiti da 100 microlitri di tampone di estrazione, portando il volume fino a 200 microlitri. Aggiungere questa miscela alle colonne di spin del glutatione bilanciate, quindi tappare le colonne di spin e ruotarle per 30 minuti, consentendo agli accompagnatori di legarsi alla resina.
Dopo la rotazione, ruotare brevemente le colonne. Raccogli il flow-through, che è il materiale pre-eliminato impoverito di proteine aggregate. Metterlo su ghiaccio e procedere direttamente al test di estrazione.
Preparare i tubi per l'analisi SDS-PAGE. Aggiungere 45 microlitri di acqua distillata doppia al tubo di ingresso, 40 microlitri d'acqua al tubo passante e 16,6 microlitri di buffer di caricamento 4X SDS-PAGE a ciascun tubo. Per il test di estrazione, preparare la reazione di estrazione e portare il volume finale a 200 microlitri con il tampone di estrazione.
Quindi, preriscaldare il test di estrazione in un blocco di calore a 30 gradi Celsius per due minuti. Per iniziare il test, aggiungere ATP a una concentrazione finale di due millimoli. Ruotare il tubo per cinque secondi in un PicoFuge e incubarlo a 30 gradi Celsius per 30 minuti.
Durante l'incubazione, prelevare un campione di cinque microlitri della reazione e aggiungerlo al tubo di ingresso. Inoltre, equilibrare una colonna di spin del glutatione per ciascun campione nel test di estrazione, come dimostrato in precedenza. Una volta completata l'incubazione di 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di tampone di estrazione al tubo, portando il volume totale a 400 microlitri.
Quindi, aggiungere questa reazione alla resina di glutatione equilibrata e lasciarla ruotare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la rotazione, ruotare le colonne per raccogliere il flusso passante, quindi prelevare un campione di 10 microlitri per il tubo passante. Lavare la resina due volte con 400 microlitri di tampone di estrazione, scartando il flusso dopo ogni lavaggio.
Dopo il terzo lavaggio, mantenere il flusso e prelevare un campione di 50 microlitri per il tubo di lavaggio. Quindi, preparare cinque millilitri di tampone di eluizione aggiungendo glutatione ridotto a una concentrazione finale di cinque millimoli nel tampone di estrazione. Aggiungere 200 microlitri del tampone di eluizione alla colonna di spin e incubare per cinque minuti.
Quindi, centrifugare la colonna e raccogliere il flusso attraverso. Ripetere ancora una volta il passaggio di eluizione. Dopo la seconda eluizione, prelevare un'aliquota di 50 microlitri dal campione di eluizione e aggiungerla al tubo di eluizione.
Dopo aver eseguito un western blot, l'efficienza di estrazione può essere determinata confrontando la quantità di substrato nella frazione eluta con la frazione di input. Il segnale nel flusso attraverso mostra una certa variabilità, ma è generalmente simile alla frazione di ingresso e non c'è segnale nella frazione di lavaggio. In genere, vi è un'efficienza di estrazione di circa il 10% per il controllo positivo e un'efficienza di estrazione da uno al 2% per il controllo negativo.
Quando le condizioni di ricostituzione non sono ottimizzate, i livelli di estrazione sono comparabili tra i campioni positivi e negativi. Questa tecnica ha permesso al nostro laboratorio di testare le proprietà biofisiche del substrato influenzano il riconoscimento da parte di Msp1.
