Questo protocollo dimostra un metodo avanzato per l'approvvigionamento di cellule epiteliali dentali umane. È difficile identificare il pellet di cella aggregato durante le procedure. Fai attenzione quando maneggi il surnatante per prevenire la perdita di popolazioni cellulari.
Per iniziare, raccogliere i follicoli dentali durante l'estrazione chirurgica dei terzi molari colpiti. Avviare le procedure di isolamento cellulare o conservare i follicoli dentali a quattro gradi Celsius in DPBS con il 3% di penicillina-streptomicina. Per lavare i follicoli dentali, tenere il follicolo dentale con una pinzetta e metterlo nel tubo di lavaggio 1.
Agitare delicatamente da 10 a 15 volte. Estrailo e mettilo nel tubo 2. Ancora una volta, agitalo da 10 a 15 volte.
Infine, estrarlo e metterlo nel tubo 3, quindi agitarlo. Dopo il lavaggio tre volte, posizionare il follicolo dentale in un piatto di coltura da 60 millimetri. Tritare il tessuto con le forbici del tessuto fino a quando il follicolo dentale ha un aspetto polposo o schiacciato.
Utilizzare una piccola sezione laterale del piatto di coltura per ridurre al minimo la perdita di tessuto. Mescolare un millilitro ciascuno di collagenasi di tipo 1 e soluzione di proteasi in un tubo conico da 15 millilitri. Trasferire il tessuto tritato nel tubo conico da 15 millilitri, quindi agitarlo delicatamente e incubarlo per un'ora a 37 gradi Celsius.
Aggiungere cinque millilitri di 0,05% tripsina-EDTA al tubo. Agitare e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Preparare un mezzo per cheratinociti contenente un mezzo privo di siero per i cheratinociti e siero bovino fetale al 10%.
Aggiungere tre millilitri di cheratinociti in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Posizionare un filtro da 40 micrometri sopra questo tubo. Quindi, aspirare il surnatante dal tubo contenente il tessuto con una pipetta sierologica da 10 millilitri e passarlo attraverso il filtro.
Trasferire la sospensione raccolta in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare il tubo e rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere tre millilitri di mezzo privo di siero per cheratinociti.
Centrifugare per altri tre minuti e rimuovere il surnatante. Placcare la popolazione di singole cellule in un piatto di coltura da 60 millimetri usando il mezzo privo di siero di cheratinociti. Mantenere il piatto di coltura con un volume finale di cinque millilitri in un'atmosfera umidificata del 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius.
Le cellule con morfologia epiteliale sono apparse entro sette-10 giorni dopo la placcatura di popolazioni monocellulari. Il numero di cellule epiteliali a forma di ciottolo variava da una a 10 al momento dell'emergenza e le cellule si espansero in colonie nel tempo. Il passo più cruciale è tritare il follicolo dentale in piccole particelle.
Migliora la separazione delle singole cellule dal tessuto follicolare. Le cellule mesenchimali possono essere isolate dal follicolo dentale umano. L'ambiente di coltura contenente siero seleziona le cellule mesenchimali e inibisce la crescita epiteliale da popolazioni di singole cellule.
Questo protocollo fornisce il metodo per procurare le cellule epiteliali dentali umane. Le cellule epiteliali derivate dal follicolo dentale possono essere utilizzate per lo studio delle interazioni epiteliali-mesenchimali dentali.
