La quantità di informazioni provenienti da un solo esperimento è enorme. Possiamo rilevare la presenza di questi polimeri a parete cellulare e sapere esattamente come sono distribuiti in cellule e tessuti, e persino determinarne l'abbondanza. Questo metodo è progettato in modo tale che possa essere applicato a quasi tutti i tipi di tessuto vegetale di qualsiasi specie che si possa voler analizzare.
L'immunolocalizzazione nei tessuti vegetali comporta un sacco di lavoro meticoloso, difficile da spiegare senza vedere realmente cosa succede. Prima di raccogliere il campione di tessuto vegetale, riempire una fiala di vetro con una soluzione fissante a freddo sufficiente per immergere completamente tutti i campioni. Quindi selezionare i tessuti vegetali da analizzare e tagliare i campioni a una dimensione non superiore a 16 millimetri quadrati.
Immergere immediatamente i campioni nella soluzione fissante. La glutaraldeide e la formaldeide sono entrambi ottimi fissatori, ma entrambi sono pericolosi e devono essere maneggiati nella cappa di flusso. Trasferire il flaconcino in una camera a vuoto e applicare lentamente il vuoto.
Quando la pressione raggiunge -60 kilo pascal, il materiale galleggiante nella fiala inizierà ad affondare sul fondo. Mantenere la pressione nella camera a non più di -80 kilo pascal. Il processo di affondamento può richiedere fino a due ore.
Dopo che i campioni sono stati nella camera a vuoto per due ore, rilasciare lentamente il vuoto. Sigillare la fiala di vetro e refrigera durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo la fissazione notturna, scartare tutti i campioni che non sono affondati sul fondo del flaconcino.
Lavare i campioni rimanenti con 25 PBS millimolare per 10 minuti e quindi lavarli in tampone PIPES da 25 millimolare per 20 minuti. È estremamente importante rimuovere tutti i campioni galleggianti perché è altamente probabile che il fissatore non sia penetrato nel campione. Disidratare i campioni in una serie di etanolo, immergendo i campioni per 20 minuti ad ogni concentrazione di etanolo.
Per perfondere i campioni, aggiungere concentrazioni crescenti di resina LR-bianca in etanolo, a partire da una parte di resina a tre parti di etanolo. Ad ogni concentrazione, incubare per 24 ore a quattro gradi Celsius. Sostituire la resina lr-bianca con resina fresca e incubare i campioni per altre 12 ore a quattro gradi Celsius.
Preparare le capsule di gelatina incorporanti, selezionando capsule leggermente più grandi dei campioni in modo che i campioni possano essere completamente racchiusi nella resina. Etichettare le etichette di carta con matita perché l'inchiostro contaminerà la resina. Applicare una goccia di resina fresca LR-bianca sul fondo di ogni capsula.
Posizionare un campione in ogni capsula, quindi riempire le capsule alla massima capacità con resina fresca. Mettere il cappuccio sulla capsula e premere delicatamente per sigillare. Per polimerizzare la resina, polimerizzare le capsule a 58 gradi Celsius fino a quando non sono completamente indurite intorno alle 24-48 ore.
Dopo aver sbucciato la capsula di gelatina dalla resina bianca LR, posizionare il blocco di resina sotto il microscopio stereo. Utilizzando una lama affilata, tagliare il blocco LR-white con un angolo di 45 gradi rispetto al campione. Ruotare il campione e fare un secondo taglio con un angolo di 90 gradi al primo.
Continuare a tagliare nello stesso modello per formare una piramide con l'apice della piramide direttamente sopra l'area di interesse del campione, quindi iniziare a rimuovere le fette sottili perpendicolari all'asse maggiore fino a quando la superficie di taglio raggiunge il campione. Il campione di destinazione dovrebbe idealmente essere racchiuso in una forma trapezio. Posizionare il blocco di resina rifilato nell'ultra microtomo.
Regolare l'angolo tra il bordo del coltello e il blocco di resina. Tagliare sezioni dal blocco con uno spessore compreso tra 200 e 700 nanometri. Utilizzare un anello metallico per sollevare con cura alcune sezioni campiolate dal microtomo.
Mettili in una goccia di acqua deionizzata distillata su uno scivolo di vetro. Evaporare l'acqua posizionando lo scivolo su una piastra calda a 50 gradi Celsius, quindi aggiungere una goccia di macchia alle sezioni. Dopo 30 secondi, sciacquare la macchia e osservare lo scivolo al microscopio per verificare lo stato generale della sezione e che la struttura della pianta desiderata sia visibile.
Preparare uno scivolo di reazione pulito posizionando una goccia di acqua deionizzata distillata in ogni pozzo dello scivolo. Trasferire una o due sezioni campione in ogni goccia d'acqua. Posizionare lo scivolo in una piastra di Petri quadrata di 10 centimetri, coprirlo e lasciarlo asciugare a 50 gradi Celsius.
Per preparare una camera di incubazione per le diapositive di reazione, posizionare alcuni tovaglioli di carta inumiditi nella parte inferiore di una scatola di punte di pipetta e avvolgere la scatola con un foglio di alluminio. Trasferire le diapositive dalla scatola alla camera di incubazione. Pipettare 50 microlitri di soluzione di blocco in ogni pozzo.
Dopo aver incubato lo scivolo per 10 minuti, rimuovere la soluzione di blocco, quindi lavare tutti i pozzali due volte con PBS per 10 minuti ogni volta. Dopo aver preparato le soluzioni anticorpali primarie come descritto nel manoscritto, eseguire un lavaggio finale dei pozzi con acqua distillata per cinque minuti. Pipettare la soluzione anticorpale primaria nei pozzi di reazione, quindi pipettare la soluzione di blocco nei pozzi di controllo.
Chiudere la camera di incubazione. Lascialo riposare per due ore a temperatura ambiente e poi refrigera durante la notte a quattro gradi Celsius. Preparare una soluzione all'1% dell'anticorpo secondario nella soluzione di blocco.
Saranno necessari circa 40 microlitri per pozzo. Coprire la soluzione con un foglio di alluminio. Lavare i pozzi dello scivolo di reazione due volte con PBS e una volta con acqua deionizzata distillata per 10 minuti ogni volta.
Assicurarsi che nessuna soluzione di blocco o depositi rimanga nei pozzi. Pipettare la soluzione anticorpale secondaria in tutti i pozzi. Incubare gli scivoli al buio a temperatura ambiente per tre o quattro ore.
Ancora una volta, lavare i pozzi dello scivolo di reazione due volte con PBS e una volta con acqua deionizzata distillata, quindi aggiungere una goccia di Calcofluor White ad ogni pozzo. Senza lavaggio, aggiungere una goccia di mezzo di montaggio ad ogni bene e coprire ogni bene con un copripavi. Osservare le sezioni del campione nella diapositiva di reazione utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Per ogni osservazione, utilizzare un filtro UV per rilevare le pareti cellulari macchiate dal Calcofluor e un filtro FITC per rilevare l'immunolocalizzazione. Per una migliore visualizzazione dei risultati, utilizzare ImageJ o un programma di analisi delle immagini simile per unire ogni immagine del filtro UV con l'immagine del filtro FITC corrispondente. Individuando la localizzazione di epitopi specifici, il protocollo consente la caratterizzazione della composizione della parete cellulare.
Ad esempio, 1, 5-arabinan è abbondante nella parete cellulare dell'ante Quercus suber in via di sviluppo. Gli omogalattiuronan appena esterificati si trovano tipicamente sulla punta della radice dell'embrione Quercus suber specificando le proprietà meccaniche dell'organo. Gli xilogalacturoni si trovano nelle cellule degenerante, come la cellula endosperma durante le fasi finali della maturazione della ghianda Quercus suber.
Gli epitopi dell'AGP riconosciuti da JIM13 o JIM8 si trovano su strutture legate alla riproduzione, come le linee cellulari legate alla microgametogenesi nella thaliana arabidopsis e le papille stigmatiche e microbiche dell'angiosperma basale Trithuria submersa. Gli errori comuni nell'implementazione di questo protocollo sono in genere facili da rilevare e identificare. Quando i lavaggi vengono saltati o i pozzi di reazione sono autorizzati ad asciugarsi, l'anticorpo secondario di solito apparirà come uno striscio.
Aggregati di fluorocromo verde si formeranno se l'anticorpo primario non legato non viene lavato via correttamente. La piegatura o il distacco delle sezioni è solitamente correlato a una scarsa adesione a causa dell'uso di scivoli impuri o lavaggio aggressivo. Anche la preparazione del campione è fondamentale.
I blocchi di resina dovrebbero essere liberi da crepe con un campione chiaramente visibile dal giallo pallido al marrone chiaro. Campioni incorporati in modo inefficiente mostreranno macchie o aree bianche polverose. Mantenere la dimensione del campione sotto gli otto millimetri è essenziale per la penetrazione della soluzione fissante.
Campioni scarsamente fissati appariranno marrone scuro o quasi nero. Una temperatura eccessiva può causare la rottura della resina rendendo impossibile il sessamento del campione. L'uso di tecniche di immunolocalizzazione apre diverse direzioni di ricerca.
Si può seguire con tecniche più specifiche come l'analisi biochimica della parete cellulare o persino procedere ad un approccio molecolare. I risultati forniti da questa tecnica possono aiutare a comprendere la composizione della parete cellulare, una struttura estremamente complessa molto difficile da analizzare con una semplice analisi chimica.
