Il Max Planck Society e uno stipendio Gottinga Graduate School Junior Gruppo HB finanziato questo lavoro.

1. Gli strumenti, di coltura, e piatti <ol><li> Utilizzare un microscopio che è in grado di mantenere il campione selezionato e che è dotato di una fase automatica. Costruire un calorifero coperchio su misura o acquistare una soluzione commerciale. Impostare un sistema di telecamere a LED-EMCCD in cui l&#39;esposizione della fotocamera trigger illuminazione LED attraverso un segnale TTL con le istruzioni del produttore. Nota: vedere Consigli per i dettagli. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) francobolli: <ol><li> Realizzare PDMS francobolli in un impianto di microfluidica o che abbiano le PDMS francobolli prodotte da una fonderia commerciale. Per usare una fonderia commerciale, inviare un file autocad alla società e specificare la profondità (15 micron, ad esempio) del dispositivo. Dopo la consegna dalla fonderia, tagliate il chip PDMS nei suoi 16 francobolli con un bisturi. </li><li> Incollare ogni singolo francobollo di un vetrino con plasma ad aria. Per l&#39;incollaggio, esporre sia il timbro PDMS e il vetrino di plasma ad aria per unaattacco 1 min (utilizzando le impostazioni più alte di plasma a 0,5 mbar). Assicurarsi che le superfici di incollaggio rivolti verso l&#39;alto durante il trattamento al plasma. Quindi, mettere il timbro PDMS sul vetrino. </li></ol></li><li> Dai piatto fondo di 3,5 cm e tagliare una superficie quadrata di 18 x 18 mm dal centro del fondo del piatto con una fresatrice verticale e taglierine taglienti. Utilizzare bassa velocità di rotazione della fresa e l&#39;alimentazione lenta per impedire la plastica da fusione a causa di calore prodotto per attrito. Preparare diversi piatti contemporaneamente. Nota: Il piatto inferiore può essere riutilizzato più volte dopo l&#39;esperimento, se è pulito dopo immersione in puro etanolo O / N. </li><li> Agarosio: <ol><li> Sciogliere 3 g alta punto di fusione agarosio in 100 ml S-basali (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in etanolo), H 2 O a 1 L, sterilizzare in autoclave), facendo bollire. Preparare delle aliquote del disciolto agarosio in 2 ml provette Eppendorf e store. Inoltre, preparare un lotto di basso punto di fusione agarosio esattamente allo stesso modo del punto agarosio alta fusione. </li><li> Prima dell&#39;uso, posizionare 3 aliquote di alto punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C. Prima dell&#39;uso, posizionare un&#39;aliquota di basso punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C fino a quando non è fuso e poi su una piastra riscaldante a 30 - 35 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Selezione degli animali <ol><li> Crescere i vermi a bassa densità su piastre NGM teste di serie per ottenere animali puri. Assicurarsi che non vi è abbondanza di cibo e solo pochi animali sul piatto. </li><li> Per l&#39;imaging L1 larve, trasferire circa 30 uova contenenti embrioni allo stadio di pretzel su un piatto fresco seminato NGM. Per il trasferimento di fasi successive larvali o adulti C. elegans, il trasferimento di circa 30 vermi su un piatto fresco seminato NGM. </li></ol> 3. Preparazione di agarosio microchambers <ol><li> Preparazione del piatto: <ol><li>Prendere un piatto di plastica con una apertura quadrata di 18 x 18 mm in basso e posizionarlo a rovescio con l&#39;apertura rivolta verso l&#39;alto. Chiudere l&#39;apertura mettendo un pezzo di nastro biadesivo appiccicoso di 20 x 20 mm sull&#39;apertura. Ruotare il piatto intorno in modo che il nastro adesivo è sul fondo e posizionare il piatto su una superficie dura. Tagliare l&#39;apertura libera con un bisturi. </li><li> Usando una pipetta P1000, occupare 2 ml di 3% di alta punto di fusione agarosio in S-basale nel piatto. Inserire l&#39;agarosio sulla zona che circonda l&#39;apertura e lasciare solidificare. Attendere che l&#39;agarosio è solido. </li><li> Girare intorno al piatto e staccare la pellicola protettiva che ricopre il nastro adesivo su due lati in modo che la parte adesiva rimane sul piatto e verrà esposta. Nota: Come risultato, un sottile anello di nastro adesivo circonderà all&#39;esterno dell&#39;apertura. L&#39;agarosio funge da serbatoio di umidità che poi circondare il campione. </li></ol></li><li> Casting di microchambers: <ol><li> Esporre the superficie PDMS per lo stampaggio con plasma ad aria per 20 - 60 sec. Nota: Questo trattamento al plasma rende PDMS superficie idrofila, che impedisce l&#39;intrappolamento di bolle d&#39;aria e produce stampe nitide. </li><li> Costruire due distanziatori di uguale altezza impilando 5-9 vetrini. Place, parallelamente ai loro lati lunghi, il primo gruppo distanziali, poi un singolo vetrino, poi ancora una pila distanziale. Posizionare il vetrino che contiene il timbro PDMS ortogonalmente attraverso i distanziali. Regolare l&#39;altezza dei distanziatori in modo che vi sia uno spazio di circa 1,5 mm tra la superficie di formatura dello stampo PDMS e il singolo vetrino. </li><li> Mettere una goccia di liquido caldo ad alto punto di fusione agarosio sul vetrino singolo vicino al timbro PDMS e rapidamente scivolare il PDMS bollo verticalmente nel agarosio liquido. Lasciate che il agarosio solidificare. Verificare che diventa un aspetto opaco, che di solito dura circa 2 minuti. Estrarre il timbro in verticale con un movimento. Nota: E &#39;conveniente per glue il distanziatore scorre insieme con nastro biadesivo appiccicoso. Il movimento verticale del timbro impedisce bolle d&#39;aria dal rimanere intrappolati in agarosio. </li></ol></li><li> Trasferire le uova o vermi insieme con i batteri OP50 sul agarosio utilizzando una raffinata scelta filo di platino. Distribuire un uovo o una vite senza fine per ogni camera insieme con il cibo usando un ciglio. Riempire circa 30 uova su un pad agarosio. </li><li> Tagliare lastra agarosio contenente i microchambers riempite in un quadrato di circa 15 x 15 mm in modo che si adatta bene nell&#39;apertura del piatto. Sollevare la lastra di agarosio piazza con una pinza e posizionarlo a testa in giù su un vetrino di vetro di 20 x 20 mm. Una volta sceso, non sollevare di nuovo o scorrere in giro perché ciò può causare i batteri e vermi per essere spinto fuori dalle loro stanze. </li><li> Montaggio del piatto: <ol><li> Posizionare il coprioggetto di vetro sulla apertura del piatto di plastica. Premere delicatamente verso il basso il vetrino di vetro sul ring in doppia faccia nastro adesivo.Fare attenzione a non rompere il vetro. </li><li> Girare il piatto a testa in giù e usare una pipetta P1000 per colmare il divario tra la soletta agar contenente le microchambers e il serbatoio agarosio con liquido a basso punto di fusione agarosio raffreddata a circa 30 ° C. Attendere che l&#39;agarosio si è solidificato. </li><li> Sigillare il piatto con un coperchio. Per microscopi invertiti utilizzare un coperchio riscaldato. Per microscopi diritti utilizzare un coperchio normale e sigillare il piatto con Parafilm. </li></ol></li><li> Dopo aver terminato la preparazione di microchambers, controllarli sotto uno stereomicroscopio. Il ripieno corretta è fondamentale. Vedi la discussione per i dettagli. </li></ol> 4. Imaging di calcio <ol><li> Utilizzare ceppi transgenici che esprimono sensori di calcio geneticamente codificati quali HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Utilizzare un microscopio composto attrezzato per tutto il campo epifluorescenza. Collegare l&#39;uscita TTL della fotocamera EMCCD al&#39;ingresso TTL del LED, in modo che ogni volta che la fotocamera registra un fotogramma campione sarà illuminato. Utilizzare un tempo di esposizione di circa 5 msec. Utilizzare guadagno EM nel range di 50-300. </li><li> Specificare una corsa film di scoppio per 24 ore con ogni verme essere ripreso ogni 15-30 minuti prima per 20 secondi con DIC, poi per 20 secondi con una fluorescenza GFP per registrare GCaMP, e poi prendere una immagine finale del segnale mKate2 è preso a di controllo per i livelli di espressione. Utilizzare un frame rate di 2 / sec durante ogni raffica. </li><li> Per il controllo dei dati visivi, usare una mappa falsi colori per migliorare la visibilità delle piccole variazioni di intensità di fluorescenza. Dati fluorescenti trama come Af / F, con F è il valore medio basale di fluorescenza. Una descrizione dettagliata di analisi dei dati calcio può essere trovato in letteratura 20. </li></ol> 5. parallelo AMI di multiple Worms <ol><li> Porre la capsula contenente i microchambers sul microscopio, concentrarsi sul campione e coinvolgere il autofocus. Impostare un protocollo software in modo che la fotocamera acquisisce una raffica di 40 fotogrammi di immagini in 20 secondi ogni mezz&#39;ora per 24 ore, che si tradurrà in 1.920 fotogrammi al verme, una ragionevole quantità di dati. Impostare la scansione in modo che visita ogni verme con il palcoscenico. Lo scopo di filmare circa 30 vermi in una corsa. </li><li> Immagine più vermi per lo zoom out, vale a dire, con un ingrandimento minore. Utilizzare un ingrandimento inferiore per coprire più microchambers con il chip telecamera e filmare contemporaneamente più microchambers adiacenti. Dopo la fine della acquisizione dell&#39;immagine, separare i dati per ogni singola camera ritagliando una regione di interesse che copre un animale. </li><li> Per valutare rapidamente i dati di mobilità, utilizzare telaio sottrazione 28-32. </li></ol> 6. Imaging diverse fasi della vita di C. elegans <ol><li> Utilizzare microchambers agarosio per tutte le fasi della vita di C. elegans da L1 a compresi dauers adulti e. Utilizzare i opportune dimensioni della camera per difle fasi della vita di- che sono indicati nella tabella 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fase di vita </td><td> Formato da Camera </td><td> Profondità fornello </td><td> Tempo di registrazione tipico </td><td> Ingrandimento </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 micron </td><td> 10 - 15 micron </td><td> uovo - mid L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 micron </td><td> 15 micron </td><td> uovo - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larva </td><td> 370 x 370 micron </td><td> 25 micron </td><td> 4 giorni </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 micron </td><td> 45 micron </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 micron </td><td> 45 micron </td><td> giovane L4 - giovane adulto </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Giovani adulti </td><td> 700 x 700 micron </td><td> 45 micron </td&gt; <td> 12 - 24 ore </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tabella 1. formati da camera per diverse fasi della vita. Visualizzati sono Dimensioni camera e ingrandimenti che sono utili per varie fasi ottimizzate per un chip telecamera 8 x 8 mm.

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P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Hardware L&#39;obiettivo di un microscopio tipicamente deriva durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine a lungo termine. Per microscopi composti, focus-mantenendo sistemi possono essere acquistati presso i maggiori produttori microscopio. Nel caso in cui un microscopio composto con controllo di fuoco è troppo caro, una semplice alternativa sarebbe quella di utilizzare uno stereomicroscopio. Microscopi composti consentono l&#39;uso di obiettivi con alta apertura numerica (NA) e può essere facilmente automatizzato. Obiettivi olio 40X sono adatti. Lenti immersione in acqua non sono l&#39;ideale per l&#39;evaporazione durante l&#39;imaging a lungo termine. Contrasto interferenziale differenziale (DIC) genera un piacevole contrasto che aiuta a seguire i cambiamenti morfologici e comportamentali, ma semplice per immagini campo luminoso può essere utilizzato anche. Per DIC o l&#39;imaging campo chiaro, utilizzare la luce rossa posizionando un filtro di luce rossa nel percorso dia-illuminazione del microscopio. Per la scansione di diversi microchambers è necessaria una fase automatizzata. Miglior performance è achieved quando una fase è utilizzato che ha l&#39;accelerazione lineare e decelerazione e può essere impostato a bassa velocità di scansione per evitare di disturbare gli animali durante la scansione. Non abbiamo osservato le risposte comportamentali o aumento di calcio nei neuroni meccanosensibili (ALM e PLM) durante la scansione, suggerendo anzi che la scansione lenta non attivare il sistema meccanosensibili del worm (dati non riportati). Sistemi commerciali LED possono essere utilizzate. Diverse aziende offrono soluzioni pronte per l&#39;uso che comprendono i LED a diverse lunghezze d&#39;onda. Il LED deve avere la possibilità di innescare esternamente LED con un segnale TTL. Una telecamera altamente sensibile è necessaria per l&#39;imaging di calcio degli animali in movimento. Telecamere EMCCD sono le telecamere più sensibili sul mercato. La telecamera deve avere un&#39;uscita TTL durante l&#39;esposizione (detta anche output &quot;fuoco&quot;). Un riscaldatore coperchio è necessaria per evitare la formazione di condensa sul coperchio se si usa un microscopio invertito. Su un microscopio verticale, il piatto viene posizionato in modo che il coperchio will essere in basso e quindi la condensazione è impedito e non necessita riscaldamento coperchio. Il coperchio deve chiudere ermeticamente il piatto per evitare l&#39;evaporazione di acqua durante l&#39;imaging a lungo termine. PDMS francobolli La superficie del timbro PDMS che contiene la struttura per lo stampaggio l&#39;agarosio è affrontato dal vetrino, che supporta il timbro PDMS. Una lista con le aziende che offrono chip microfluidici personalizzato può essere trovato su Wikipedia ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Riempimento dei nematodi nelle loro camere Questa è la fase più critica del protocollo ei seguenti punti deve essere considerato: A) L&#39;umidità del agarosio è fondamentale per trasferire i vermi e per l&#39;imaging. Se l&#39;agarosio è troppo umida, ossia, c&#39;è una COV liquidorendo un&#39;area di diversi microchambers, non sarà possibile distribuire cibo batterica e vermi in modo controllato perché il liquido farà batteri defluire. Se l&#39;agarosio è troppo asciutto, quindi i batteri e vermi non possono scendere il pick facilmente il che significa che maggiore forza deve essere utilizzato per eliminare i vermi e batteri che causano facilmente danneggiare il agarosio. Nel compilare un sacco di vermi agarosio può asciugare. Nel peggiore dei casi l&#39;agarosio sarà così asciutto alla fine che le camere crollerà. Se l&#39;agarosio è troppo secca può essere reidratato mettendo una piccola goccia (circa 2 ml) di S-basale sul lato del chip dove non ci sono vermi. Poi immergere il filo di platino raccogliere nel liquido e anche tirare una parte del liquido nella zona in cui le camere sono piene di vermi. B) La quantità di cibo è fondamentale per il successo di imaging a lungo termine. Se non c&#39;è abbastanza cibo, i vermi possono correre fuori di esso. Se c&#39;è cibo eccessiva la cavità della cameranon si comporterà come un liquido, ma piuttosto come un solido e consentirà worm per fuggire dalla camera spingendo i batteri. Obiettivo per ottenere una sospensione batterica che riempie l&#39;intera camera. I vermi sono in costante contatto fisico con la superficie di agar e vetro lungo la maggior parte della loro lunghezza durante l&#39;esperimento e il comportamento strisciando sembra essere simile al movimento su un piatto e dissimile da thrashing in liquido. C) meccanica danneggiamento del agarosio può rovinare l&#39;esperimento. Una bella scelta è essenziale. Non dovrebbe avere spigoli vivi. Un ciglia morbido attaccato ad una punta di pipetta può essere utilizzato per spostare batteri o vermi nelle camere invece di utilizzare un pick platino. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, agarosio eccessiva asciugatura è la ragione per danni. Il pick o ciglia dovrebbero, idealmente, solo toccare appena l&#39;agarosio in sé, e la pellicola d&#39;acqua sulla superficie di agarosio dovrebbe tirare fuori i vermi e batteri. Quando sigillando le camere, di nuovo, l&#39;umidità del agarosio è essenziale. Non ci dovrebbeessere qualsiasi liquido libero sulla superficie agarosio perché questo può lavare via i batteri e vermi durante la saldatura. Grandi bolle possono essere rimosse sollevando delicatamente un angolo della lastra agar. Piccole bolle che sono più piccole della camera spesso intrappolate all&#39;interno delle camere. Queste bolle non sono un problema e spariranno per assorbimento. Dopo il montaggio del piatto, verificare ancora una volta che l&#39;agarosio non è troppo secca o troppo umida. Le camere devono essere ben sigillati e non ci dovrebbe essere qualsiasi flusso di liquido tra le camere. Se l&#39;agarosio è troppo bagnato, le camere non corretta tenuta. Worms possono sfuggire o il loro cibo sarà spazzato via. Se il campione è troppo umida, semplice aprire il coperchio e lasciare asciugare agarosio per un minuto o due. Se l&#39;agarosio è troppo secca, le camere possono crollare e il worm si sfuggire. Scaling da zoom out Per l&#39;imaging di fluorescenza, zoom indietro è limitata dalla scarsa quantità di luce ottenuta a visualizzazioni ridotte. Inoltre, ETelecamere MCCD sono ottimizzati per la sensibilità e spesso hanno una risoluzione relativamente bassa. Tuttavia, scaling up di immagini di quattro volte è ben possibile. Ad esempio, quattro camere di 190 micron x 190 micron può andare bene su un unico fotogramma utilizzando 140X ingrandimento (ottenuto utilizzando un 20X Obiettivo e una fotocamera 0,7X montaggio) e 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm fotocamera. Una telecamera ad alta risoluzione con una grande chip (come macchine fotografiche sCMOS, 16,6 millimetri di chip x 14 mm, 2560 x 2560 pixel = 5.5 Megapixel) ottimizza scaling up di CID e di imaging in campo chiaro. Ad esempio, fino a 30 vermi L1 a 190 micron x 190 micron camere può andare bene su ogni fotogramma di questa fotocamera quando si utilizza un ingrandimento 100x (vedi figura 3). In linea di principio, lo zoom indietro e di scansione può anche essere combinati per ottenere anche un numero maggiore di animali. La maggior parte dei neuroni rimangono abbastanza bene a fuoco, in modo che solo un piano focale deve essere ripreso. Se i neuroni si trovano ad uscire dal fuoco, az scansione utilizzando un sistema piezoelettrico può essere presa in ogni momento pmista. Adattamento ai diversi comportamenti Questo protocollo dà una buona idea del comportamento attraverso scale temporali lunghe. Ovviamente, la tempistica delle esplosioni deve essere adattato alle differenti comportamenti e le fasi della vita. Limitazioni della tecnica Diversi fattori limitano la durata di imaging. La più importante è la quantità di cibo. Una volta che il cibo è consumato, larve fermare lo sviluppo. Così, in piccole camere (190 x 190 micron) vermi si sviluppano fino alla fase L3 e quindi arrestano. Se è necessario un tempo più lungo di imaging, camere grandi devono essere utilizzati. La durata massima delle immagini a lungo termine è nel range di 2,5 - 3 giorni. Se è richiesta l&#39;imaging più, i vermi devono essere recuperati e inseriti in nuove camere. Quando l&#39;imaging vermi adulti, un&#39;altra limitazione è causata dalla progenie di questi worm. Worm adulte depongono le uova da cui larve si schiudono. Queste larve anche rimanere all&#39;interno della camera, Consumare cibo, e possono disturbare l&#39;analisi delle immagini. Se prole è un problema, una soluzione è usare sia per adulti sterili o per effettuare ripetutamente i vermi in camere fresche. Per recuperare i vermi, la lastra agarosio contenente la camera è tagliato gratuito con un bisturi, è tirato fuori dal vetrino, e viene posto su una piastra NGM da cui i worm possono essere recuperati. Un altro limite è la restrizione dei vermi per aree relativamente piccole. Questo può essere un problema se il movimento lungo raggio deve essere analizzato. Mentre gli animali nelle camere possono essere stimolati meccanicamente e optogenetically 21,27,34,35, la natura sigillata della camera renderà difficile applicare stimolanti solubili o volatili. Gas biologicamente importanti quali ossigeno o anidride carbonica possono diffondersi liberamente nel agar. Il grande serbatoio dell&#39;aria nel piatto dovrebbe mantenere le concentrazioni di gas nelle camere di costanti lungo il tempo necessario per gli esperimenti. Tuttavia, va tenuto presente che la concentratio ossigeno localin nella camera può assomigliare più condizioni esistenti in coltura liquida di coltura su piastra. Importanza rispetto ai metodi esistenti Dispositivi microfluidici hanno notevolmente avanzato del comportamento e dello sviluppo studiato in C. elegans. Spesso, strutture microfluidica sono fatti di PDMS 12. Qui si descrive un protocollo per la generazione di camere di coltura di microfluidica a base di agarosio. La forza di questa tecnica è la combinazione di elevata qualità delle immagini, la correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche, immagini a lungo termine, e una portata ragionevolmente alto. Alta qualità di immagine si ottiene l&#39;imaging attraverso il vetrino di vetro con obiettivi alti NA. Come risultato, imaging di fluorescenza come l&#39;imaging calcio e confocale delle strutture subcellulari può essere eseguita. Poiché gli animali non sono immobilizzati come in altri sistemi, permette una correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche. Because gli animali hanno cibo abbondante, che continuare a sviluppare permettendo di imaging a lungo termine. Questo sistema è in grado di immagine molti worm in una corsa perché gli animali sono limitate nelle loro stanze definite. Così, questo metodo può essere facilmente scalato 9,27,34-36. Le future applicazioni Finora, questo sistema è stato utilizzato principalmente per studiare il comportamento di sonno in C. elegans L1 larve. Tuttavia, l&#39;adattamento a tutte le fasi renderà possibile studiare una vasta gamma di comportamenti anche in dauers e adulti. Una vasta gamma di comportamenti può essere studiata con questa tecnica che vanno da accoppiamento per la deposizione delle uova.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>high-melting point agarose</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP(E)164-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top Vision Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED system</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>compound microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TiE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iXon 897</td>
			<td>now sold as iXon Ultra 897</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasma cleaner</td>
			<td>Harrick</td>
			<td>PDC-23G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lid heater</td>
			<td>MPI workshop</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08-757-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>z-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Nano Scan Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x-y-stage for the microscope</td>
			<td>Prior</td>
			<td>Proscan III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS stamp</td>
			<td>Abbott Laboratories&#160;</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>red light filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>ET660/50m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td colspan="2">Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double sided sticky tape</td>
			<td>Sellotape/Henkel</td>
			<td>double sided 12mm x 33 m</td>
			<td>alternatively Advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

Comportamento è controllato dal sistema nervoso. Calcio Imaging è un metodo semplice nel nematode Caenorhabditis elegans trasparente per misurare l&#39;attività di neuroni durante vari comportamenti. Per correlare attività neurale con il comportamento, l&#39;animale non deve essere immobilizzata, ma dovrebbe essere in grado di muoversi. Molti cambiamenti comportamentali si verificano durante scale temporali lunghe e richiedono la registrazione di più di molte ore di comportamento. Questo rende anche necessario cultura i vermi in presenza di cibo. Come possono i vermi essere colta e la loro attività neurale ripreso su scale temporali lunghe? Agarose Microchamber Imaging (AMI) è stato precedentemente sviluppato per la cultura e osservare piccole larve e ora è stato adattato per studiare tutte le fasi della vita dai primi di L1 fino alla fase adulta della C. elegans. AMI può essere eseguita su diverse fasi di vita di C. elegans. Calcio Imaging a lungo termine viene ottenuta senza immobilizzare gli animali utilizzando le esposizioni a breve innescate esternamente comcombinati con un elettrone moltiplicando registrazione dispositivo (EMCCD) fotocamera ad accoppiamento di carica. Zoom out o la scansione in grado di scalare fino questo metodo per immagine fino a 40 vermi in parallelo. Così, viene descritto un metodo per il comportamento di immagine e l&#39;attività neurale su scale temporali lunghe in tutti gli stadi di vita di C. elegans.

Microchambers Agarose possono essere applicati a qualsiasi fase della vita di C. elegans. Come si può vedere nella Figura 1A, sviluppo larvale e comportamento sonno durante L1 lethargus possono essere osservati. Vengono mostrati dimensioni delle camere che sono 190 x 190 micron, 10 micron di profondità. Se sono necessari tempi più lunghi, possono essere utilizzati camere più grandi. Come si vede in Figura 1B, utilizzando una camera di dimensioni maggiori (370 x 370 micron, 25 micron profondo) consente lo sviluppo di C. elegans da uovo fino adulto. Figura 1C mostra l&#39;analisi dei cambiamenti a lungo termine nel comportamento con telaio sottrazione di un verme cresciuto in una camera da uovo fino adulta. Indicato sono intensità media dopo telaio sottrazione per raffiche selezionati durante veglia e lethargus. Minore è l&#39;intensità media dopo valori telaio sottrazione è, minore è la mobilità del verme. Indicato sono selezionati scoppio tracce da una condizione veglia e una condizione lethargus per stadio larvale. Ilosservato aumento di intensità media durante lo sviluppo è dovuto principalmente alla maggiore contrasto e dimensioni dell&#39;animale. figura 1D mostra una larva dauer, una fase di vita alternativo che opera in condizioni ambientali avverse 33. Formato da Camera è di 370 x 370 micron, 15 micron di profondità. Si noti che la larva Dauer è stata posta nella camera senza cibo batterica, che causerebbe l&#39;uscita dalla fase larvale Dauer. La figura 1E mostra un verme adulto che ha già gettato molte uova nella camera. Dimensioni camera utilizzate per l&#39;adulto sono 700 x 700 micron, 45 micron di profondità. Infine, la Figura 1F mostra un ermafrodita adulto e un accoppiamento maschio all&#39;interno di una camera adulta. Calcio Imaging in vermi motilità è possibile con sensori di calcio GCaMP. Figure 2A, B spettacolo Imaging di calcio del comando interneurone AVA per una larva L1 27. Figure 2C, D mostrano l&#39;attività di calcio per la sami tipo di neurone in un animale adulto. Scaling up di imaging a lungo termine è possibile attraverso la scansione e zoom out. Figura 3A mostra la qualità delle immagini delle immagini simultanea di 30 vermi su un unico chip fotocamera con una fotocamera da 5 megapixel. Figura 3B mostra la qualità dell&#39;immagine di 4 vermi calcio ripreso contemporaneamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Adeguamento della AMI a tutte le fasi della vita di C. elegans. (A) Larva ripreso dai primi di L1 fino all&#39;inizio fase L2 in 190 x 190 micron camere. (B) per lo sviluppo da uovo fino adulto in una camera di 370 x 370 micron. (C) La mobilità di un worm valutata utilizzando telaio sottrazione. Viene mostrato l&#39;intensità media di tutte le foto dell&#39;immagine dopo telaio sottrazione di un film raffica selezionato per ogni sta larvalege per svegliarsi e comportamento lethargus. (D) Un dauer larva in assenza di cibo in una camera 370 x 370 um. Ermafrodita (E) per adulti con molte uova deposte in una camera di 700 x 700 micron. (F) L&#39;accoppiamento di un maschio e una ermafrodita all&#39;interno di una camera 700 x 700 um. YA significa giovane adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Imaging di calcio con IMA. (A) Calcio Imaging con GCaMP3 nel comando interneurone AVA di L1 larve utilizzando la NMR-1 promotore. Indicato sono due immagini a falsi colori. Nell&#39;immagine di sinistra, l&#39;attività di AVA è bassa e il verme non sta compiendo un movimento all&#39;indietro. Nell&#39;immagine a destra l&#39;attività di AVA è<html> alta, e il verme si muove all&#39;indietro. transitori (B) di calcio nel corso del tempo per un worm L1. (C, D) transienti di calcio in un animale adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Imaging più vermi in parallelo con lo zoom out. (A) l&#39;imaging simultaneo di 30 L1 vermi per fotogramma con 190 x 190 micron camere e un ingrandimento 100X (con un obiettivo 10X) e un chip di fotocamera 16,6 x 14 mm. (B) l&#39;imaging simultaneo di quattro vermi L3 per fotogramma con 370 x 370 micron camere e 100X ingrandimento e una regione di interesse di un chip fotocamera 16,6 x 14 mm.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.4K Views.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

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C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Ricerca

Neuroscienze

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lettura molecolare di lungo termine adattamento olfattivo nel<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Metodi per studiare i meccanismi d&#39;azione di farmaci antipsicotici in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and social interactions can be best studied by observing unrestrained, freely behaving animals. Weakly electric fish (WEF) display readily observable exploratory and social behaviors by emitting electric organ discharge (EOD). Here, we describe three effective techniques to synchronously measure the EOD, body position, and posture of a free-swimming WEF for an extended period of time. First, we describe the construction of an experimental tank inside of an isolation chamber designed to block external sources of sensory stimuli such as light, sound, and vibration. The aquarium was partitioned to accommodate four test specimens, and automated gates remotely control the animals&#39; access to the central arena. Second, we describe a precise and reliable real-time EOD timing measurement method from freely swimming WEF. Signal distortions caused by the animal&#39;s body movements are corrected by spatial averaging and temporal processing stages. Third, we describe an underwater near-infrared imaging setup to observe unperturbed nocturnal animal behaviors. Infrared light pulses were used to synchronize the timing between the video and the physiological signal over a long recording duration. Our automated tracking software measures the animal&#39;s body position and posture reliably in an aquatic scene. In combination, these techniques enable long term observation of spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish in a reliable and precise manner. We believe our method can be similarly applied to the study of other aquatic animals by relating their physiological signals with exploratory or social behaviors.

We describe a set of techniques for studying spontaneous behavior of freely swimming weakly electric fish over an extended period of time, by synchronously measuring the animal&#39;s electric organ discharge timing, body position and posture both accurately and reliably in a specially designed aquarium tank inside a sensory isolation chamber.

A lungo termine comportamentale inseguimento di Liberamente Nuoto debolmente elettrico Pesce

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

A lungo termine Time Lapse Imaging del mouse cocleari Espianti

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generazione e manutenzione a lungo termine di nervi liberi<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...