Name: agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Il Max Planck Society e uno stipendio Gottinga Graduate School Junior Gruppo HB finanziato questo lavoro.

1. Gli strumenti, di coltura, e piatti <ol><li> Utilizzare un microscopio che è in grado di mantenere il campione selezionato e che è dotato di una fase automatica. Costruire un calorifero coperchio su misura o acquistare una soluzione commerciale. Impostare un sistema di telecamere a LED-EMCCD in cui l&#39;esposizione della fotocamera trigger illuminazione LED attraverso un segnale TTL con le istruzioni del produttore. Nota: vedere Consigli per i dettagli. </li><li> Polydimethylsiloxan (PDMS) francobolli: <ol><li> Realizzare PDMS francobolli in un impianto di microfluidica o che abbiano le PDMS francobolli prodotte da una fonderia commerciale. Per usare una fonderia commerciale, inviare un file autocad alla società e specificare la profondità (15 micron, ad esempio) del dispositivo. Dopo la consegna dalla fonderia, tagliate il chip PDMS nei suoi 16 francobolli con un bisturi. </li><li> Incollare ogni singolo francobollo di un vetrino con plasma ad aria. Per l&#39;incollaggio, esporre sia il timbro PDMS e il vetrino di plasma ad aria per unaattacco 1 min (utilizzando le impostazioni più alte di plasma a 0,5 mbar). Assicurarsi che le superfici di incollaggio rivolti verso l&#39;alto durante il trattamento al plasma. Quindi, mettere il timbro PDMS sul vetrino. </li></ol></li><li> Dai piatto fondo di 3,5 cm e tagliare una superficie quadrata di 18 x 18 mm dal centro del fondo del piatto con una fresatrice verticale e taglierine taglienti. Utilizzare bassa velocità di rotazione della fresa e l&#39;alimentazione lenta per impedire la plastica da fusione a causa di calore prodotto per attrito. Preparare diversi piatti contemporaneamente. Nota: Il piatto inferiore può essere riutilizzato più volte dopo l&#39;esperimento, se è pulito dopo immersione in puro etanolo O / N. </li><li> Agarosio: <ol><li> Sciogliere 3 g alta punto di fusione agarosio in 100 ml S-basali (5,85 g NaCl, 1 g K 2 HPO 4, 6 g KH 2 PO 4, 1 ml di colesterolo (5 mg / ml in etanolo), H 2 O a 1 L, sterilizzare in autoclave), facendo bollire. Preparare delle aliquote del disciolto agarosio in 2 ml provette Eppendorf e store. Inoltre, preparare un lotto di basso punto di fusione agarosio esattamente allo stesso modo del punto agarosio alta fusione. </li><li> Prima dell&#39;uso, posizionare 3 aliquote di alto punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C. Prima dell&#39;uso, posizionare un&#39;aliquota di basso punto di fusione agarosio su un blocco di riscaldamento a 95-98 ° C fino a quando non è fuso e poi su una piastra riscaldante a 30 - 35 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Selezione degli animali <ol><li> Crescere i vermi a bassa densità su piastre NGM teste di serie per ottenere animali puri. Assicurarsi che non vi è abbondanza di cibo e solo pochi animali sul piatto. </li><li> Per l&#39;imaging L1 larve, trasferire circa 30 uova contenenti embrioni allo stadio di pretzel su un piatto fresco seminato NGM. Per il trasferimento di fasi successive larvali o adulti C. elegans, il trasferimento di circa 30 vermi su un piatto fresco seminato NGM. </li></ol> 3. Preparazione di agarosio microchambers <ol><li> Preparazione del piatto: <ol><li>Prendere un piatto di plastica con una apertura quadrata di 18 x 18 mm in basso e posizionarlo a rovescio con l&#39;apertura rivolta verso l&#39;alto. Chiudere l&#39;apertura mettendo un pezzo di nastro biadesivo appiccicoso di 20 x 20 mm sull&#39;apertura. Ruotare il piatto intorno in modo che il nastro adesivo è sul fondo e posizionare il piatto su una superficie dura. Tagliare l&#39;apertura libera con un bisturi. </li><li> Usando una pipetta P1000, occupare 2 ml di 3% di alta punto di fusione agarosio in S-basale nel piatto. Inserire l&#39;agarosio sulla zona che circonda l&#39;apertura e lasciare solidificare. Attendere che l&#39;agarosio è solido. </li><li> Girare intorno al piatto e staccare la pellicola protettiva che ricopre il nastro adesivo su due lati in modo che la parte adesiva rimane sul piatto e verrà esposta. Nota: Come risultato, un sottile anello di nastro adesivo circonderà all&#39;esterno dell&#39;apertura. L&#39;agarosio funge da serbatoio di umidità che poi circondare il campione. </li></ol></li><li> Casting di microchambers: <ol><li> Esporre the superficie PDMS per lo stampaggio con plasma ad aria per 20 - 60 sec. Nota: Questo trattamento al plasma rende PDMS superficie idrofila, che impedisce l&#39;intrappolamento di bolle d&#39;aria e produce stampe nitide. </li><li> Costruire due distanziatori di uguale altezza impilando 5-9 vetrini. Place, parallelamente ai loro lati lunghi, il primo gruppo distanziali, poi un singolo vetrino, poi ancora una pila distanziale. Posizionare il vetrino che contiene il timbro PDMS ortogonalmente attraverso i distanziali. Regolare l&#39;altezza dei distanziatori in modo che vi sia uno spazio di circa 1,5 mm tra la superficie di formatura dello stampo PDMS e il singolo vetrino. </li><li> Mettere una goccia di liquido caldo ad alto punto di fusione agarosio sul vetrino singolo vicino al timbro PDMS e rapidamente scivolare il PDMS bollo verticalmente nel agarosio liquido. Lasciate che il agarosio solidificare. Verificare che diventa un aspetto opaco, che di solito dura circa 2 minuti. Estrarre il timbro in verticale con un movimento. Nota: E &#39;conveniente per glue il distanziatore scorre insieme con nastro biadesivo appiccicoso. Il movimento verticale del timbro impedisce bolle d&#39;aria dal rimanere intrappolati in agarosio. </li></ol></li><li> Trasferire le uova o vermi insieme con i batteri OP50 sul agarosio utilizzando una raffinata scelta filo di platino. Distribuire un uovo o una vite senza fine per ogni camera insieme con il cibo usando un ciglio. Riempire circa 30 uova su un pad agarosio. </li><li> Tagliare lastra agarosio contenente i microchambers riempite in un quadrato di circa 15 x 15 mm in modo che si adatta bene nell&#39;apertura del piatto. Sollevare la lastra di agarosio piazza con una pinza e posizionarlo a testa in giù su un vetrino di vetro di 20 x 20 mm. Una volta sceso, non sollevare di nuovo o scorrere in giro perché ciò può causare i batteri e vermi per essere spinto fuori dalle loro stanze. </li><li> Montaggio del piatto: <ol><li> Posizionare il coprioggetto di vetro sulla apertura del piatto di plastica. Premere delicatamente verso il basso il vetrino di vetro sul ring in doppia faccia nastro adesivo.Fare attenzione a non rompere il vetro. </li><li> Girare il piatto a testa in giù e usare una pipetta P1000 per colmare il divario tra la soletta agar contenente le microchambers e il serbatoio agarosio con liquido a basso punto di fusione agarosio raffreddata a circa 30 ° C. Attendere che l&#39;agarosio si è solidificato. </li><li> Sigillare il piatto con un coperchio. Per microscopi invertiti utilizzare un coperchio riscaldato. Per microscopi diritti utilizzare un coperchio normale e sigillare il piatto con Parafilm. </li></ol></li><li> Dopo aver terminato la preparazione di microchambers, controllarli sotto uno stereomicroscopio. Il ripieno corretta è fondamentale. Vedi la discussione per i dettagli. </li></ol> 4. Imaging di calcio <ol><li> Utilizzare ceppi transgenici che esprimono sensori di calcio geneticamente codificati quali HBR16 (goeIs5 [PNMR-1 :: SL1-GCaMP3.35-SL2 :: unc-54-3&#39;UTR, unc-119 (+)]) 27. </li><li> Utilizzare un microscopio composto attrezzato per tutto il campo epifluorescenza. Collegare l&#39;uscita TTL della fotocamera EMCCD al&#39;ingresso TTL del LED, in modo che ogni volta che la fotocamera registra un fotogramma campione sarà illuminato. Utilizzare un tempo di esposizione di circa 5 msec. Utilizzare guadagno EM nel range di 50-300. </li><li> Specificare una corsa film di scoppio per 24 ore con ogni verme essere ripreso ogni 15-30 minuti prima per 20 secondi con DIC, poi per 20 secondi con una fluorescenza GFP per registrare GCaMP, e poi prendere una immagine finale del segnale mKate2 è preso a di controllo per i livelli di espressione. Utilizzare un frame rate di 2 / sec durante ogni raffica. </li><li> Per il controllo dei dati visivi, usare una mappa falsi colori per migliorare la visibilità delle piccole variazioni di intensità di fluorescenza. Dati fluorescenti trama come Af / F, con F è il valore medio basale di fluorescenza. Una descrizione dettagliata di analisi dei dati calcio può essere trovato in letteratura 20. </li></ol> 5. parallelo AMI di multiple Worms <ol><li> Porre la capsula contenente i microchambers sul microscopio, concentrarsi sul campione e coinvolgere il autofocus. Impostare un protocollo software in modo che la fotocamera acquisisce una raffica di 40 fotogrammi di immagini in 20 secondi ogni mezz&#39;ora per 24 ore, che si tradurrà in 1.920 fotogrammi al verme, una ragionevole quantità di dati. Impostare la scansione in modo che visita ogni verme con il palcoscenico. Lo scopo di filmare circa 30 vermi in una corsa. </li><li> Immagine più vermi per lo zoom out, vale a dire, con un ingrandimento minore. Utilizzare un ingrandimento inferiore per coprire più microchambers con il chip telecamera e filmare contemporaneamente più microchambers adiacenti. Dopo la fine della acquisizione dell&#39;immagine, separare i dati per ogni singola camera ritagliando una regione di interesse che copre un animale. </li><li> Per valutare rapidamente i dati di mobilità, utilizzare telaio sottrazione 28-32. </li></ol> 6. Imaging diverse fasi della vita di C. elegans <ol><li> Utilizzare microchambers agarosio per tutte le fasi della vita di C. elegans da L1 a compresi dauers adulti e. Utilizzare i opportune dimensioni della camera per difle fasi della vita di- che sono indicati nella tabella 1. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fase di vita </td><td> Formato da Camera </td><td> Profondità fornello </td><td> Tempo di registrazione tipico </td><td> Ingrandimento </td></tr><tr><td> L1 </td><td> 190 x 190 micron </td><td> 10 - 15 micron </td><td> uovo - mid L2 </td><td> 400X </td></tr><tr><td> L2 </td><td> 370 x 370 micron </td><td> 15 micron </td><td> uovo - L3 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> Dauer larva </td><td> 370 x 370 micron </td><td> 25 micron </td><td> 4 giorni </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L3 </td><td> 700 x 700 micron </td><td> 45 micron </td><td> L2 - L4 </td><td> 200X </td></tr><tr><td> L4 </td><td> 700 x 700 micron </td><td> 45 micron </td><td> giovane L4 - giovane adulto </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Giovani adulti </td><td> 700 x 700 micron </td><td> 45 micron </td&gt; <td> 12 - 24 ore </td><td> 100X </td></tr></tbody></table> Tabella 1. formati da camera per diverse fasi della vita. Visualizzati sono Dimensioni camera e ingrandimenti che sono utili per varie fasi ottimizzate per un chip telecamera 8 x 8 mm.

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P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus.">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1, 12-14 (2012).</li><li>Schwarz, J., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sleep-like+quiescence+in+both+hyperactive+and+hypoactive+mutants+of+the+Galphaq+Gene+egl-30+during+lethargus+in+Caenorhabditis+elegans.">Reduced sleep-like quiescence in both hyperactive and hypoactive mutants of the Galphaq Gene egl-30 during lethargus in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 8, e75853 (2013).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Hardware L&#39;obiettivo di un microscopio tipicamente deriva durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine a lungo termine. Per microscopi composti, focus-mantenendo sistemi possono essere acquistati presso i maggiori produttori microscopio. Nel caso in cui un microscopio composto con controllo di fuoco è troppo caro, una semplice alternativa sarebbe quella di utilizzare uno stereomicroscopio. Microscopi composti consentono l&#39;uso di obiettivi con alta apertura numerica (NA) e può essere facilmente automatizzato. Obiettivi olio 40X sono adatti. Lenti immersione in acqua non sono l&#39;ideale per l&#39;evaporazione durante l&#39;imaging a lungo termine. Contrasto interferenziale differenziale (DIC) genera un piacevole contrasto che aiuta a seguire i cambiamenti morfologici e comportamentali, ma semplice per immagini campo luminoso può essere utilizzato anche. Per DIC o l&#39;imaging campo chiaro, utilizzare la luce rossa posizionando un filtro di luce rossa nel percorso dia-illuminazione del microscopio. Per la scansione di diversi microchambers è necessaria una fase automatizzata. Miglior performance è achieved quando una fase è utilizzato che ha l&#39;accelerazione lineare e decelerazione e può essere impostato a bassa velocità di scansione per evitare di disturbare gli animali durante la scansione. Non abbiamo osservato le risposte comportamentali o aumento di calcio nei neuroni meccanosensibili (ALM e PLM) durante la scansione, suggerendo anzi che la scansione lenta non attivare il sistema meccanosensibili del worm (dati non riportati). Sistemi commerciali LED possono essere utilizzate. Diverse aziende offrono soluzioni pronte per l&#39;uso che comprendono i LED a diverse lunghezze d&#39;onda. Il LED deve avere la possibilità di innescare esternamente LED con un segnale TTL. Una telecamera altamente sensibile è necessaria per l&#39;imaging di calcio degli animali in movimento. Telecamere EMCCD sono le telecamere più sensibili sul mercato. La telecamera deve avere un&#39;uscita TTL durante l&#39;esposizione (detta anche output &quot;fuoco&quot;). Un riscaldatore coperchio è necessaria per evitare la formazione di condensa sul coperchio se si usa un microscopio invertito. Su un microscopio verticale, il piatto viene posizionato in modo che il coperchio will essere in basso e quindi la condensazione è impedito e non necessita riscaldamento coperchio. Il coperchio deve chiudere ermeticamente il piatto per evitare l&#39;evaporazione di acqua durante l&#39;imaging a lungo termine. PDMS francobolli La superficie del timbro PDMS che contiene la struttura per lo stampaggio l&#39;agarosio è affrontato dal vetrino, che supporta il timbro PDMS. Una lista con le aziende che offrono chip microfluidici personalizzato può essere trovato su Wikipedia ( <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies" target="_blank">http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_microfluidics_related_companies</a> ). Riempimento dei nematodi nelle loro camere Questa è la fase più critica del protocollo ei seguenti punti deve essere considerato: A) L&#39;umidità del agarosio è fondamentale per trasferire i vermi e per l&#39;imaging. Se l&#39;agarosio è troppo umida, ossia, c&#39;è una COV liquidorendo un&#39;area di diversi microchambers, non sarà possibile distribuire cibo batterica e vermi in modo controllato perché il liquido farà batteri defluire. Se l&#39;agarosio è troppo asciutto, quindi i batteri e vermi non possono scendere il pick facilmente il che significa che maggiore forza deve essere utilizzato per eliminare i vermi e batteri che causano facilmente danneggiare il agarosio. Nel compilare un sacco di vermi agarosio può asciugare. Nel peggiore dei casi l&#39;agarosio sarà così asciutto alla fine che le camere crollerà. Se l&#39;agarosio è troppo secca può essere reidratato mettendo una piccola goccia (circa 2 ml) di S-basale sul lato del chip dove non ci sono vermi. Poi immergere il filo di platino raccogliere nel liquido e anche tirare una parte del liquido nella zona in cui le camere sono piene di vermi. B) La quantità di cibo è fondamentale per il successo di imaging a lungo termine. Se non c&#39;è abbastanza cibo, i vermi possono correre fuori di esso. Se c&#39;è cibo eccessiva la cavità della cameranon si comporterà come un liquido, ma piuttosto come un solido e consentirà worm per fuggire dalla camera spingendo i batteri. Obiettivo per ottenere una sospensione batterica che riempie l&#39;intera camera. I vermi sono in costante contatto fisico con la superficie di agar e vetro lungo la maggior parte della loro lunghezza durante l&#39;esperimento e il comportamento strisciando sembra essere simile al movimento su un piatto e dissimile da thrashing in liquido. C) meccanica danneggiamento del agarosio può rovinare l&#39;esperimento. Una bella scelta è essenziale. Non dovrebbe avere spigoli vivi. Un ciglia morbido attaccato ad una punta di pipetta può essere utilizzato per spostare batteri o vermi nelle camere invece di utilizzare un pick platino. Nella maggior parte dei casi, tuttavia, agarosio eccessiva asciugatura è la ragione per danni. Il pick o ciglia dovrebbero, idealmente, solo toccare appena l&#39;agarosio in sé, e la pellicola d&#39;acqua sulla superficie di agarosio dovrebbe tirare fuori i vermi e batteri. Quando sigillando le camere, di nuovo, l&#39;umidità del agarosio è essenziale. Non ci dovrebbeessere qualsiasi liquido libero sulla superficie agarosio perché questo può lavare via i batteri e vermi durante la saldatura. Grandi bolle possono essere rimosse sollevando delicatamente un angolo della lastra agar. Piccole bolle che sono più piccole della camera spesso intrappolate all&#39;interno delle camere. Queste bolle non sono un problema e spariranno per assorbimento. Dopo il montaggio del piatto, verificare ancora una volta che l&#39;agarosio non è troppo secca o troppo umida. Le camere devono essere ben sigillati e non ci dovrebbe essere qualsiasi flusso di liquido tra le camere. Se l&#39;agarosio è troppo bagnato, le camere non corretta tenuta. Worms possono sfuggire o il loro cibo sarà spazzato via. Se il campione è troppo umida, semplice aprire il coperchio e lasciare asciugare agarosio per un minuto o due. Se l&#39;agarosio è troppo secca, le camere possono crollare e il worm si sfuggire. Scaling da zoom out Per l&#39;imaging di fluorescenza, zoom indietro è limitata dalla scarsa quantità di luce ottenuta a visualizzazioni ridotte. Inoltre, ETelecamere MCCD sono ottimizzati per la sensibilità e spesso hanno una risoluzione relativamente bassa. Tuttavia, scaling up di immagini di quattro volte è ben possibile. Ad esempio, quattro camere di 190 micron x 190 micron può andare bene su un unico fotogramma utilizzando 140X ingrandimento (ottenuto utilizzando un 20X Obiettivo e una fotocamera 0,7X montaggio) e 512 x 512 pixel, 8 x 8 mm fotocamera. Una telecamera ad alta risoluzione con una grande chip (come macchine fotografiche sCMOS, 16,6 millimetri di chip x 14 mm, 2560 x 2560 pixel = 5.5 Megapixel) ottimizza scaling up di CID e di imaging in campo chiaro. Ad esempio, fino a 30 vermi L1 a 190 micron x 190 micron camere può andare bene su ogni fotogramma di questa fotocamera quando si utilizza un ingrandimento 100x (vedi figura 3). In linea di principio, lo zoom indietro e di scansione può anche essere combinati per ottenere anche un numero maggiore di animali. La maggior parte dei neuroni rimangono abbastanza bene a fuoco, in modo che solo un piano focale deve essere ripreso. Se i neuroni si trovano ad uscire dal fuoco, az scansione utilizzando un sistema piezoelettrico può essere presa in ogni momento pmista. Adattamento ai diversi comportamenti Questo protocollo dà una buona idea del comportamento attraverso scale temporali lunghe. Ovviamente, la tempistica delle esplosioni deve essere adattato alle differenti comportamenti e le fasi della vita. Limitazioni della tecnica Diversi fattori limitano la durata di imaging. La più importante è la quantità di cibo. Una volta che il cibo è consumato, larve fermare lo sviluppo. Così, in piccole camere (190 x 190 micron) vermi si sviluppano fino alla fase L3 e quindi arrestano. Se è necessario un tempo più lungo di imaging, camere grandi devono essere utilizzati. La durata massima delle immagini a lungo termine è nel range di 2,5 - 3 giorni. Se è richiesta l&#39;imaging più, i vermi devono essere recuperati e inseriti in nuove camere. Quando l&#39;imaging vermi adulti, un&#39;altra limitazione è causata dalla progenie di questi worm. Worm adulte depongono le uova da cui larve si schiudono. Queste larve anche rimanere all&#39;interno della camera, Consumare cibo, e possono disturbare l&#39;analisi delle immagini. Se prole è un problema, una soluzione è usare sia per adulti sterili o per effettuare ripetutamente i vermi in camere fresche. Per recuperare i vermi, la lastra agarosio contenente la camera è tagliato gratuito con un bisturi, è tirato fuori dal vetrino, e viene posto su una piastra NGM da cui i worm possono essere recuperati. Un altro limite è la restrizione dei vermi per aree relativamente piccole. Questo può essere un problema se il movimento lungo raggio deve essere analizzato. Mentre gli animali nelle camere possono essere stimolati meccanicamente e optogenetically 21,27,34,35, la natura sigillata della camera renderà difficile applicare stimolanti solubili o volatili. Gas biologicamente importanti quali ossigeno o anidride carbonica possono diffondersi liberamente nel agar. Il grande serbatoio dell&#39;aria nel piatto dovrebbe mantenere le concentrazioni di gas nelle camere di costanti lungo il tempo necessario per gli esperimenti. Tuttavia, va tenuto presente che la concentratio ossigeno localin nella camera può assomigliare più condizioni esistenti in coltura liquida di coltura su piastra. Importanza rispetto ai metodi esistenti Dispositivi microfluidici hanno notevolmente avanzato del comportamento e dello sviluppo studiato in C. elegans. Spesso, strutture microfluidica sono fatti di PDMS 12. Qui si descrive un protocollo per la generazione di camere di coltura di microfluidica a base di agarosio. La forza di questa tecnica è la combinazione di elevata qualità delle immagini, la correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche, immagini a lungo termine, e una portata ragionevolmente alto. Alta qualità di immagine si ottiene l&#39;imaging attraverso il vetrino di vetro con obiettivi alti NA. Come risultato, imaging di fluorescenza come l&#39;imaging calcio e confocale delle strutture subcellulari può essere eseguita. Poiché gli animali non sono immobilizzati come in altri sistemi, permette una correlazione di comportamento con misurazioni fisiologiche. Because gli animali hanno cibo abbondante, che continuare a sviluppare permettendo di imaging a lungo termine. Questo sistema è in grado di immagine molti worm in una corsa perché gli animali sono limitate nelle loro stanze definite. Così, questo metodo può essere facilmente scalato 9,27,34-36. Le future applicazioni Finora, questo sistema è stato utilizzato principalmente per studiare il comportamento di sonno in C. elegans L1 larve. Tuttavia, l&#39;adattamento a tutte le fasi renderà possibile studiare una vasta gamma di comportamenti anche in dauers e adulti. Una vasta gamma di comportamenti può essere studiata con questa tecnica che vanno da accoppiamento per la deposizione delle uova.

Caenorhabditis elegans has been established as a model system to study behavior1. Due to its amenability to genetics, the molecular and cellular mechanisms underlying behavior can be studied. Many behaviors occur on long time scales. Two principal approaches can be used to observe motile animals over long time scales. The first approach is following the animal during movement using an automated stage or camera2-8 and the second is to restrict the movement to a range that is at least as small as the field of view of the camera9-14. Both methods have their advantages. Tracking allows following an animal over long spatial ranges but limits the number of animals that can be discerned in one experiment. Restricting the movement of the animals allows scaling up the observation to many individuals at the same time by using arrays of restricted compartments. 
Because the nematode is transparent, live fluorescent imaging can be performed non-invasively15. Calcium imaging provides a functional readout for the activity of excitable cells and is established for C. elegans16-20. Calcium enters the cell via channels in the plasma membrane that open upon depolarization. Thus, calcium acts as a proxy for neural activity. Calcium sensors can be grouped in two major classes, ratiometric and non-ratiometric sensors. Both classes employ conformational changes of calcium-binding proteins induced upon binding of calcium. Ratiometric sensors contain two fluorescent proteins. When the lower-wavelength fluorescent protein is excited, a part of the light energy is transmitted to the higher wavelength fluorescent protein as a function of their distance in a process called Fluorescence Resonance Energy Transfer or F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)21. Non-ratiometric sensors are based on circularly permuted GFP and employ de-quenching of the fluorophore caused by calcium binding22. Each class has its advantages. While ratiometric sensors are less sensitive to movement or expression artifacts, non-ratiometric sensors typically have a higher dynamic range. Both ratiometric and non-ratiometric sensors have been useful to study the activity of excitable cells in C. elegans16-20,23,24. 
When doing long-term fluorescence imaging, the experimenter will have to deal with several potential challenges: 1. Disturbance of behavior through excitation light: Worms are sensitive to short-wavelength fluorescence excitation light and avoid light from the violet to blue range that is used for calcium imaging25,26. Worms respond with either a backward or a forward escape response25,26. Thus, the amount of light needs to be controlled. 2. Bleaching of the fluorescent sensor protein: Often, bleaching of the fluorescent protein hampers long-term imaging. Typically, however, light intensities that are needed to observe bleaching are higher than the light intensities that cause disturbing effects on the behavior of the animals. Thus, bleaching is only a theoretical problem in this type of calcium imaging. 3. Worms inside the microchambers are not fixed and move constantly during wake behavior and images may appear blurred if the worm is not immobilized. All these challenges can be solved using extremely short exposure times with low light intensity. This can be realized by using a highly sensitive EMCCD camera with short exposure times and external triggering of a light emitting diode (LED). To expose the worms to the illumination light as briefly as possible (only during the exposure time of the camera) the LED is externally triggered using a transistor-transistor logic (TTL) signal that the camera emits during exposure resulting in an illumination of the worm for precisely the time the camera chip is exposed. This also means that the EMCCD chip will be dark during data readout, which is optimal for readout performance of this chip. 
Previously, agarose microchambers have been developed for long-term fluorescence imaging of C. elegans larvae9. Here, it is described how agarose micro-chambers can be used for long-term calcium imaging for any life stage of C. elegans, how calcium imaging can be performed, and how this method can be upscaled to assay many individual worms in parallel.

<table><tbody><tr><td>High melting point agarose</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP(E)164-1000</td><td></td></tr><tr><td>Top Vision low melting point agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0801</td><td></td></tr><tr><td>LED system</td><td>CoolLED</td><td>pE-2</td><td></td></tr><tr><td>Compound microscope</td><td>Nikon</td><td>TiE</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>now sold as iXon Ultra 897</td></tr><tr><td>sCMOS camera</td><td>Andor</td><td>Neo</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick</td><td>PDC-23G2</td><td></td></tr><tr><td>Lid heater</td><td>MPI workshop</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Falcon</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Z-stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Nano Scan Z</td><td></td></tr><tr><td>X-Y stage for the microscope</td><td>Prior</td><td>Proscan III</td><td></td></tr><tr><td>PDMS stamp</td><td>Abbott Laboratories</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>Red light filter</td><td>Chroma</td><td>ET660/50m</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>Falcon</td><td>Falcon Disposable Petri Dishes, Sterile, Corning</td><td></td></tr><tr><td>Double sided sticky tape</td><td>Sellotape/Henkel</td><td>double sided 25 mm x 33 m</td><td>alternatively advance double sided sticky tape from Rubance Adhesives can be used.</td></tr></tbody></table>

agarose microchambers for long-term calcium imaging of caenorhabditis elegans

Comportamento è controllato dal sistema nervoso. Calcio Imaging è un metodo semplice nel nematode Caenorhabditis elegans trasparente per misurare l&#39;attività di neuroni durante vari comportamenti. Per correlare attività neurale con il comportamento, l&#39;animale non deve essere immobilizzata, ma dovrebbe essere in grado di muoversi. Molti cambiamenti comportamentali si verificano durante scale temporali lunghe e richiedono la registrazione di più di molte ore di comportamento. Questo rende anche necessario cultura i vermi in presenza di cibo. Come possono i vermi essere colta e la loro attività neurale ripreso su scale temporali lunghe? Agarose Microchamber Imaging (AMI) è stato precedentemente sviluppato per la cultura e osservare piccole larve e ora è stato adattato per studiare tutte le fasi della vita dai primi di L1 fino alla fase adulta della C. elegans. AMI può essere eseguita su diverse fasi di vita di C. elegans. Calcio Imaging a lungo termine viene ottenuta senza immobilizzare gli animali utilizzando le esposizioni a breve innescate esternamente comcombinati con un elettrone moltiplicando registrazione dispositivo (EMCCD) fotocamera ad accoppiamento di carica. Zoom out o la scansione in grado di scalare fino questo metodo per immagine fino a 40 vermi in parallelo. Così, viene descritto un metodo per il comportamento di immagine e l&#39;attività neurale su scale temporali lunghe in tutti gli stadi di vita di C. elegans.

Microchambers Agarose possono essere applicati a qualsiasi fase della vita di C. elegans. Come si può vedere nella Figura 1A, sviluppo larvale e comportamento sonno durante L1 lethargus possono essere osservati. Vengono mostrati dimensioni delle camere che sono 190 x 190 micron, 10 micron di profondità. Se sono necessari tempi più lunghi, possono essere utilizzati camere più grandi. Come si vede in Figura 1B, utilizzando una camera di dimensioni maggiori (370 x 370 micron, 25 micron profondo) consente lo sviluppo di C. elegans da uovo fino adulto. Figura 1C mostra l&#39;analisi dei cambiamenti a lungo termine nel comportamento con telaio sottrazione di un verme cresciuto in una camera da uovo fino adulta. Indicato sono intensità media dopo telaio sottrazione per raffiche selezionati durante veglia e lethargus. Minore è l&#39;intensità media dopo valori telaio sottrazione è, minore è la mobilità del verme. Indicato sono selezionati scoppio tracce da una condizione veglia e una condizione lethargus per stadio larvale. Ilosservato aumento di intensità media durante lo sviluppo è dovuto principalmente alla maggiore contrasto e dimensioni dell&#39;animale. figura 1D mostra una larva dauer, una fase di vita alternativo che opera in condizioni ambientali avverse 33. Formato da Camera è di 370 x 370 micron, 15 micron di profondità. Si noti che la larva Dauer è stata posta nella camera senza cibo batterica, che causerebbe l&#39;uscita dalla fase larvale Dauer. La figura 1E mostra un verme adulto che ha già gettato molte uova nella camera. Dimensioni camera utilizzate per l&#39;adulto sono 700 x 700 micron, 45 micron di profondità. Infine, la Figura 1F mostra un ermafrodita adulto e un accoppiamento maschio all&#39;interno di una camera adulta. Calcio Imaging in vermi motilità è possibile con sensori di calcio GCaMP. Figure 2A, B spettacolo Imaging di calcio del comando interneurone AVA per una larva L1 27. Figure 2C, D mostrano l&#39;attività di calcio per la sami tipo di neurone in un animale adulto. Scaling up di imaging a lungo termine è possibile attraverso la scansione e zoom out. Figura 3A mostra la qualità delle immagini delle immagini simultanea di 30 vermi su un unico chip fotocamera con una fotocamera da 5 megapixel. Figura 3B mostra la qualità dell&#39;immagine di 4 vermi calcio ripreso contemporaneamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Adeguamento della AMI a tutte le fasi della vita di C. elegans. (A) Larva ripreso dai primi di L1 fino all&#39;inizio fase L2 in 190 x 190 micron camere. (B) per lo sviluppo da uovo fino adulto in una camera di 370 x 370 micron. (C) La mobilità di un worm valutata utilizzando telaio sottrazione. Viene mostrato l&#39;intensità media di tutte le foto dell&#39;immagine dopo telaio sottrazione di un film raffica selezionato per ogni sta larvalege per svegliarsi e comportamento lethargus. (D) Un dauer larva in assenza di cibo in una camera 370 x 370 um. Ermafrodita (E) per adulti con molte uova deposte in una camera di 700 x 700 micron. (F) L&#39;accoppiamento di un maschio e una ermafrodita all&#39;interno di una camera 700 x 700 um. YA significa giovane adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Imaging di calcio con IMA. (A) Calcio Imaging con GCaMP3 nel comando interneurone AVA di L1 larve utilizzando la NMR-1 promotore. Indicato sono due immagini a falsi colori. Nell&#39;immagine di sinistra, l&#39;attività di AVA è bassa e il verme non sta compiendo un movimento all&#39;indietro. Nell&#39;immagine a destra l&#39;attività di AVA è<html> alta, e il verme si muove all&#39;indietro. transitori (B) di calcio nel corso del tempo per un worm L1. (C, D) transienti di calcio in un animale adulto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52742/52742fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52742/52742fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Imaging più vermi in parallelo con lo zoom out. (A) l&#39;imaging simultaneo di 30 L1 vermi per fotogramma con 190 x 190 micron camere e un ingrandimento 100X (con un obiettivo 10X) e un chip di fotocamera 16,6 x 14 mm. (B) l&#39;imaging simultaneo di quattro vermi L3 per fotogramma con 370 x 370 micron camere e 100X ingrandimento e una regione di interesse di un chip fotocamera 16,6 x 14 mm.et = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

9.5K Views.  Max Planck Institute for Biophysical Chemistry. Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans. 

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

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Biochimica

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscienze

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. Animals cope with these stimuli by modifying their behavior. Understanding the mechanisms underlying such behavioral modification requires quantification of neural activity during the behavior of interest. Here, we report a method for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with nonlocalized vibration of specific frequency, displacement, and duration. This method allows the production of well-controlled, nonlocalized vibration using an acoustic transducer and quantification of evoked calcium responses at single-cell resolution. As a proof of principle, the calcium response of a single interneuron, AVA, during the escape response of C. elegans to vibration is demonstrated. This system will facilitate understanding of neural mechanisms underlying behavioral responses to mechanical stimuli.

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Reported here is a system for calcium imaging in freely behaving Caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration. This system allows researchers to evoke nonlocalized vibrations with well-controlled properties at nano-scale displacement and to quantify calcium currents during responses of C. elegans to the vibrations.

Imaging del calcio in Caenorhabditis elegans che si comporta liberamente con vibrazioni ben controllate e non localizzate

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Comportamento

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

Bioingegneria

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Tracking Calcium in the Early Developmental Phases of C. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode Caenorhabditis elegans provides several unique advantages for the study of the OET as it is transparent and has an ordered gonad that produces one mature oocyte every ~23 min at 20 &#176;C. We have modified the genetically encoded calcium indicator jGCaMP7s to fluorescently indicate the moment of fertilization within a living organism. We have termed this reporter &#34;CaFE&#34; for Calcium during Fertilization in C. elegans. The CaFE reporter was&#160;engineered into a safe harbor locus in single copy, has no significant impact on physiology or fecundity, and produces a robust signal upon fertilization. Here, a series of protocols is presented for utilizing the CaFE reporter as an in vivo tool for dissecting the OET and embryogenesis. We include methods to synchronize worms, examine the effects of RNAi knockdown, mount worms for imaging, and to visualize calcium in oocytes and embryos. Additionally, we present the generation of additional worm strains to aid in this type of analysis. Demonstrating the utility of the CaFE reporter to visualize the timing of fertilization, we report that double ovulation occurs when ipp-5 is targeted by RNAi and that only the first oocyte undergoes immediate fertilization. Furthermore, the discovery of single-cell calcium transients during early embryogenesis is reported here, demonstrating that the CaFE reporter persists into early development. Importantly, the CaFE reporter in worms is simple enough to use for incorporation into course-based undergraduate research (CURE) laboratory classes. The CaFE reporter, coupled with the ordered gonad and ease of RNAi in worms, facilitates inquiry into the cell-cell dynamics required to regulate internal fertilization and early embryogenesis.

Here, we present protocols and tools for visualizing calcium during fertilization and early embryogenesis using a genetically encoded calcium reporter expressed in the germline of the model nematode C. elegans.

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

Biologia dello sviluppo

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Calcium Imaging: A Method to Visualize Neural Activity in Live C. elegans

Source: Turek, M. et al. <a href="https://www.jove.com/video/52742/agarose-microchambers-for-long-term-calcium-imaging-caenorhabditis">Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video introduces the concepts behind calcium imaging and includes an example protocol for time-lapse imaging of worms contained in molded agarose wells.

Imaging del calcio: un metodo per visualizzare l'attività neurale in C. elegans vivo

Source: Turek, M. et al. Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015).
This video ...

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio

Riepilogo

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