Gli RNA non di codifica hanno spesso più isoforme. Negli studi di sovraespressione in vitro, è spesso difficile studiare tutte queste isoforme espresse. Questa tecnica consente agli utenti di derivare l'espressione direttamente dal genoma e consentire alle cellule di esprimere le isoforme endogene per un particolare RNA non codificante.
Questa potente tecnica consente all'utente di dirigere specificamente l'espressione di qualsiasi gene nel genoma con fedeltà e precisione. Progettando RNA guida a geni specifici, si è in grado di utilizzare i macchinari endogeni di splicing genico per esprimere le isoforme naturali in una data cellula. A dimostrare la procedura sarà Robert Rankin, un post-doc del mio laboratorio.
Per progettare la sequenza di RNA guida che si trova all'interno di 100 coppie di basi del sito di partenza trascrizionale, utilizzare database genetici come BLAT per assicurarsi che l'RNA guida sia unico per il gene di interesse. Conservare l'RNA guida e i plasmidi Cas9 disattivati a quattro gradi Celsius. Striati E.coli su una piastra di agar di brodo Luria con ampicillina e fai crescere i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno dopo, scegli una colonia e fai crescere i batteri in cinque millilitri di LB con ampicillina durante la notte, scuotendo vigorosamente il tubo in un incubatore Celsius di 37 gradi. Il giorno dopo, aggiungere due millilitri di batteri a 200 millilitri di LB con ampicillina in un pallone da due litri, scuotendo vigorosamente il pallone durante la notte in un incubatore di 37 gradi Celsius. Far girare i batteri a 3.724 volte g per 20 minuti e procedere alla purificazione del DNA.
Per creare il lentivirus contenente dCas9, rivestire prima piatti di coltura tissutale da 100 millilitri con cinque millilitri dello 0,01% di poli-L-lisina e piatto cinque milioni di cellule HEK293T per piatto in 10 millilitri di Dulbecco Modificato Eagles Medium, quindi preparare campioni di trasfezione del DNA mescolando 10 microgrammi di un vettore di RNA guida contenente LTR o un vettore Cas9 disattivato contenente LTR con plasmidi contenenti componenti di virus. Aggiungere acqua a un volume totale di 450 microlitri e filtrare la miscela attraverso una punta filtrante da 0,2 micron attaccata a una siringa. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di cloruro di calcio 2,5 molare ad ogni campione di trasfezione del DNA e mescolare delicatamente.
Filtrare la miscela calcio-DNA attraverso una punta filtrante da 0,2 micron attaccata a una siringa. Pipetta 500 microlitri di 2X HBS in un tubo di polistirolo da cinque millilitri. Aggiungere 500 microlitri della miscela calcio-DNA dropwise e delicatamente vortice.
Incubare a temperatura ambiente per tre minuti. Aggiungere un millilitro della sospensione HBS DNA-calcio a ogni piatto di coltura tissutale contenente HEK293T e incubarli in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius durante la notte. Il terzo giorno, rimuovere e scartare lentamente i supporti dai piatti.
Lavare accuratamente le cellule con PBS una volta. Aggiungere sei millilitri di DMEM completo integrato con HEPES da 20 millimolare e butirato di sodio da 10 millimolare. Quindi incubare le cellule in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per cinque o sei ore.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule con PBS una volta e aggiungere cinque millilitri di DMEM completo con HEPES da 20 millimolare alle cellule HEK293T. Incubare le cellule in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per 12 ore. Il quarto giorno, raccogliere i supernatanti cellulari HEK293T e filtrare il supernatante contenente il virus.
Per iniziare il conteggio delle particelle virali, diluire prima il concentrato di lavaggio dal kit P24 ELISA aggiungendo 19 parti di acqua distillata e deionizzata. Quindi, diluire il controllo positivo da questo kit a 200 nanogrammi per millilitro usando RPMI 1640 come diluente e fare diluizioni per una curva standard in tubi da 1,5 millilitri secondo la tabella di diluizione P24 ELISA. Per misurare la concentrazione del virus all'interno dei campioni aggiungere le diluizioni del campione ai pozzi designati di una piastra da 96 pozza, a partire dalla diluizione 1:1000 e modificare il volume se necessario per essere entro l'intervallo della curva standard.
Quindi diluire i campioni con Triton X-100 a una concentrazione finale dello 0,5% e aggiungere 200 microlitri di ciascun campione e RPMI 1640 ai pozzi designati. Sigillare il piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per due ore. Lavare la piastra con 300 microlitri per pozzo del tampone di lavaggio 1X sei volte.
Rimuovere il liquido in eccesso invertendo la piastra e toccandolo su un tovagliolo di carta. Quindi aggiungere 100 microlitri di anticorpo rivelatore dal kit a tutti i pozzi tranne il vuoto del substrato. Sigillare il piatto e incubarlo a 37 gradi Celsius per un'ora.
Lavare la piastra e quindi rimuovere il liquido in eccesso invertendo la piastra e toccandolo su un tovagliolo di carta. Per misurare l'anticorpo rivelatore, diluire la perossidasi del rafano streptavidina a 1:100 diluizione con diluente SA-HRP. Mescolare accuratamente il SA-HRP diluito e aggiungere 100 microlitri a tutti i pozzi ad eccezione dello spazio vuoto.
Sigillare e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, lavare la piastra con il tampone di lavaggio 1X e toccare via il liquido in eccesso. Lasciare cadere una compressa di ortofenilendiammina in 11 millilitri del diluente del substrato per creare una soluzione di substrato sufficiente per una piastra.
Vortice la soluzione OPD vigorosamente per scioglierla completamente e proteggerla dalla luce. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato OPD a tutti i pozzi compreso il vuoto. Utilizzando uno spettrofotometro, leggere immediatamente l'assorbanza a 450 nanometri.
Ripetere 10 volte a intervalli di un secondo e prendere la misurazione media. Resuspend e coltura Jurkat T-cells in un pallone T75 con una densità di un milione di cellule in cinque millilitri del mezzo siero ridotto con polibrene. Quindi aggiungere supporti condizionati con HEK293T contenenti un milione di particelle virali contenenti dCas9.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Tre giorni dopo l'infezione, spingi le cellule a 233 g per cinque minuti e le rimospendi in 10 millilitri di DMEM completo integrato con puromicina. Coltura delle cellule nei contenitori T75 e incubarle a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%.
Ogni terzo giorno per un periodo di nove giorni, far girare le cellule a 233 volte g per cinque minuti e sostituire il supporto con il DMEM completo integrato con puromicina. Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di celle automatizzato. Quindi, su una piastra da 96 porri con tessuto trattato con coltura tissutale, aggiungere 10.000 cellule in 100 microlitri del DMEM completo integrato con puromicina nel primo pozzo.
Effettuare diluizioni seriali 1:1 del contenuto dei seguenti pozzi con il DMEM completo integrato con puromicina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Espandere le cellule clonali in due piastre da 24 po ', quindi placcare due milioni di cellule per pozzo di una piastra di sei po 'per tre dei cloni.
Placcare gli altri tre pozzi con celle di Jurkat non trasdotto come controlli. Infine, placcare le cellule in un pallone T75 e mettere le cellule in un incubatore di coltura cellulare durante la notte. Per iniziare la PCR quantitativa per misurare l'espressione genica, sintetizzare prima il DNA complementare aggiungendo un microgrammo di RNA, quattro microlitri del buffer di sintesi cDNA e un microliter di trascrittasi inversa a 250 tubi di microlitri, quindi aggiungere acqua a un volume finale di 20 microlitri.
Quindi, utilizzare un ciclore termico a 42 gradi Celsius per 30 minuti e a 95 gradi Celsius per cinque minuti per inattivare la transcriptasi inversa. Diluire il cDNA con 60 microlitri di acqua dopo la sintesi. Eseguire reazioni a catena della polimerasi per tubi contenenti 0,5 microlitri di ciascun primer avanti e indietro alla concentrazione finale di 10 micromolari, cinque microlitri di verde SIBR e quattro microlitri di cDNA.
Infine selezionare le celle Jurkat-dCas9 in DMEM integrate con igromicina B per 10 giorni. Spin giù le celle e cambiare il supporto ogni tre giorni. Purificare la RNAsi e procedere a RT-qPCR.
In questo studio, sequenze di gRNA che si trovavano entro 10-100 coppie di basi lontano dal sito di partenza trascrizionale sono state utilizzate per dirigere il complesso ad attivazione Cas9 al locus trascrizionale di IFNG-AS1, un lungo RNA non di coingere associato alla malattia infiammatoria intestinale. Per consentire la selezione di cellule doppie trasdutte, è stato utilizzato un sistema a due plasmidi per trasdurre gli esaltatori dCas9 o gRNAse nelle cellule. Qui le proteine MS2 migliorano la sovraespressione di IFNG-AS1.
L'espressione Cas9 è stata confermata per entrambi i cloni. I primer contro HPRT1 sono stati utilizzati per confermare la presenza di RNA nelle cellule non trasdotto. L'espressione di mRNA è stata confermata omettendo la transcriptasi inversa dalla reazione cDNA.
Tre varianti di giunzione di IFNG-AS1 potrebbero essere rilevate con set di primer specifici della trascrizione o un primer impostato su tutte le trascrizioni IFNG-AS1 note. Tutte le curve di fluorescenza erano esponenziali con il gene delle pulizie HPRT1 che raggiungeva la fase esponenziale entro un mezzo ciclo tra il controllo e le cellule che esprimevano gRNA IFNG-AS1. I primer contro tutte le trascrizioni IFNG-AS1 conosciute erano i più rilevabili tra gli esperimenti, con misurazioni di aumenti di 20 volte nell'espressione IFNG-AS1.
Tuttavia, la terza trascrizione di IFNG-AS1 ha mostrato un aumento significativo da cinque a 10 volte dei livelli IFNG-AS1. Per sovraesprimere attivamente il gene desiderato, la progettazione dell'RNA guida nel passaggio 2.1 è fondamentale per il successo del protocollo. Inoltre, la produzione di particelle virali di qualità garantirà una solida espressione dei componenti del protocollo.
Una volta che il gene desiderato è sovraespresso, possono essere eseguiti studi funzionali per indagare i meccanismi genici. Nel nostro esempio, abbiamo scelto di esaminare la produzione di citochine in seguito alla sovraespressione del nostro gene di interesse. Questa tecnica è stata inizialmente sviluppata dal Gruppo Griesbach Nel 2013 ed è stata ampiamente applicata ed elaborata da altri gruppi.
Eravamo entusiasti di applicare questa tecnica a lunghe RNA non codificate per esplorare le loro funzioni specifiche. I lentivirus difettosi alla replicazione devono essere trattati in un laboratorio che è stato approvato per il lavoro virale. Inoltre, le linee cellulari umane e i batteri E.coli sono considerati pericolosi per la vita.
Infine, i plasmidi del DNA ricombinante devono essere maneggiati da personale addestrato.
