Questo protocollo è significativo perché offre il primo modello di infiammazione sensibilizzato lesioni cerebrali premature nei furetti che si traduce in lesioni significative e sostenute. Questa tecnica comporta un insulto prolungato che incorpora molti dei trigger e dei meccanismi biochimici che si pensa contribuiscano ai tipi di lesioni cerebrali osservate nei neonati umani prematuri. A dimostrare la procedura di misurazione del cervello ci saranno Kylie Corry, una ricercatrice del nostro laboratorio e Olivia White, una studentessa universitaria.
Trenta minuti prima di iniziare l'intervento chirurgico, somministrare tre milligrammi per chilogrammo di LPS IP ai kit del gruppo infortuni e un volume equivalente di soluzione salina sterile di tre microlitri per grammo per controllare gli animali. Prima di iniziare la procedura, utilizzare piccole tosatrici per animali per rimuovere tutti i capelli sulla regione ventrale del collo del furetto in un motivo rettangolare, facendo attenzione a evitare di toccare la pelle o generare eruzione termica. Somministrare anestesia locale all'area rasata e disinfettare la pelle con tre tamponi alternati di iodio di povidone e etanolo al settanta per cento.
Dopo aver confermato un adeguato livello di sedazione con il dito del dito, coprire l'animale con tende sterili e monouso che espongono la regione del collo. Per la legatura bilaterale dell'arteria carotide, utilizzare una lama bisturi numero dieci per fare un'incisione della linea mediana di 1,5 centimetri al centro del collo e utilizzare emostati fini e forcep curve per sezionare senza mezzi termini fino all'arteria carotidea sinistra. Sezionare l'arteria esposta lontano dal fascio neurovascolare associato.
E usa un paio di forcep fini curve per passare una lunghezza looped di dieci centimetri di sutura di seta sterile 5/0 sotto l'arteria. Tagliare la sutura a metà e legare saldamente entrambe le lunghezze di sutura per legare l'arteria, lasciando almeno due millimetri tra i nodi. Traslitti l'arteria carotide sinistra tra le suture, facendo attenzione a lasciare intatto il nervo e ripetere la dissezione a destra.
Legare reversibilmente l'arteria carotidea destra con un'unica cravatta ombelicale sterile da 1/8 pollice. E chiudere la ferita con clip chirurgiche della pelle. Quindi, consentire all'animale di riprendersi in un bagno d'acqua a temperatura controllata per almeno trenta minuti con monitoraggio prima dell'ipossia.
Per il trattamento sequenziale di ipossia, iperossia e ipossia, posizionare gli animali nel gruppo di lesioni in una camera ermetica all'interno di un bagno d'acqua. Monitorare continuamente la concentrazione di ossigeno all'interno della camera, così come la temperatura rettale in almeno un animale sentinella. Sciacquare la camera con ossigeno umidificato al nove% e al 91% di azoto e mantenere una portata da tre a cinque litri al minuto, a seconda delle dimensioni della camera.
Una volta che la concentrazione di ossigeno nella camera ha raggiunto il nove per cento, continuare la consegna per trenta minuti. Al termine del trattamento con ipossia, passare l'alimentazione del gas all'80% di ossigeno umidificato e al 20% di azoto. Dopo trenta minuti di iperossia, aprire la camera per consentirgli di raggiungere più rapidamente la normoxia, equilibrando con aria ambiente, prima di sigillare la camera e sciacquare con il nove per cento di ossigeno umidificato di nuovo.
Monitora continuamente tutti gli animali durante questo secondo ciclo di ipossia, prendendo nota di tutti gli animali che mostrano bradipnea. Una volta che la concentrazione di ossigeno nella camera ha raggiunto il nove percento, continuare il trattamento con ipossia per trenta minuti. Al termine del trattamento, ha utilizzato forcep curvi per identificare e slegare il nastro ombelicale dall'arteria carotidea destra.
Richiudere la ferita con clip chirurgiche della pelle. Quindi riportare tutti i kit ai jills per 60 minuti per l'allattamento e il recupero. Alla fine del periodo di recupero, riportare gli animali feriti ai bagni d'acqua a 37-40 gradi Celsius per sei ore, regolando la temperatura dell'acqua in base alle esigenze, per mantenere temperature rettali da 36 a 37 gradi Celsius.
Quindi, restituisci di nuovo i kit alle loro jills. Dopo la raccolta e la fissazione cerebrale all'endpoint sperimentale appropriato, posizionare le punte di una pinza elettronica sugli aspetti dorsali e ventrali di ogni cervello per misurare l'altezza di ogni cervello ferito e non ferito. Posizionare le punte della pinza nelle porzioni più laterali dei lobi temporali per misurare la larghezza di ogni cervello e pesare ogni cervello.
Utilizzare la pinza per misurare la fessura longitudinale, tutti i solci dall'inizio e dalla fine della porzione più distinta del solco corrispondente e tutti i giroscopio dall'aspetto più ampio di ogni giro corrispondente. Quindi, posizionare una punta della pinza nel punto più posteriore della fessura longitudinale e l'altra punta della pinza nella parte più posteriore del cervelletto per misurare la quantità di cervelletto esposto. Dei 34 animali provenienti da sei cucciolate esposte all'insulto in questo studio, cinque animali hanno riportato lesioni moderate e quattro animali hanno riportato gravi lesioni.
Con l'aumento della lesione, si osserva un restringimento del giro nei lobi temporali e/o occipitali, con un associato accorciamento del solco e l'allargamento della fessura longitudinale e aree più grandi di perdita di tessuto cistico negli animali più gravemente feriti. Durante il periodo di test riflessi, gli animali feriti mostrano un tempo più lento per ruotare nel compito di geotassi negativa. Un tempo più lento per ruotare lontano dal bordo nell'attività Cliff Aversion e un tempo più lento a destra.
In passerella, gli animali feriti dimostrano una velocità media simile ai controlli, ma mostrano un grado significativamente maggiore di variazione di velocità durante ogni corsa. La distanza regolata dal peso tra le zampe e le zampe posteriori è significativamente maggiore negli animali feriti, con meno pressione esercitata per unità di area della zampa, attraverso le quattro zampe. In campo aperto, gli animali feriti coprono meno distanza totale, si fermano più frequentemente e trascorrono molto più tempo al centro del campo e meno tempo negli angoli.
Qui, si possono osservare mappe di calore rappresentative di controllo e animali feriti. Fare attenzione a sezionare l'arteria dal nervo di accompagnamento e consentire il massimo tempo possibile di ipossia. Queste misure garantiranno che la maggior parte degli animali sopravviva, sostenendo al contempo una lesione.
Seguendo questa procedura, è possibile valutare eventuali esiti biochimici, patologici o comportamentali, comprese le valutazioni che normalmente sono limitate ai modelli di roditori di lesioni cerebrali.
