Este protocolo é significativo porque oferece o primeiro modelo de inflamação sensibilizada lesão cerebral prematura nos furões que resulta em lesões significativas e sustentadas. Esta técnica envolve um insulto prolongado que incorpora muitos dos gatilhos e mecanismos bioquímicos pensados para contribuir para os tipos de lesões cerebrais vistas em bebês humanos prematuros. Demonstrando o procedimento de medição cerebral estará Kylie Corry, uma cientista de pesquisa em nosso laboratório e Olivia White, uma estudante de graduação.
Trinta minutos antes de iniciar a cirurgia, administre três miligramas por quilograma de IP LPS para kits no grupo de lesões e um volume equivalente de soro fisiológico estéril de três microlitadores por grama para controlar animais. Antes de iniciar o procedimento, use pequenos cortadores de animais para remover todos os cabelos na região do pescoço ventral do furão em um padrão retangular, tomando cuidado para evitar cortar a pele ou gerar erupção cutânea. Administre anestesia local na área raspada e desinfete a pele com três cotonetes alternados de iodo de povidone e 70% de etanol.
Após confirmar um nível apropriado de sedação por beliscão do dedo do sol, cubra o animal com cortinas estéreis e descartáveis que expõem a região do pescoço. Para ligadura arterial carótida bilateral, use uma lâmina de bisturi de uso único dez para fazer uma incisão de linha média de 1,5 centímetros no centro do pescoço e use hemostatos finos e fórceps curvos para dissecar sem rodeios até a artéria carótida esquerda. Dissecar a artéria exposta longe do feixe neurovascular associado.
E use um par de fórceps finos curvos para passar um comprimento de dez centímetros de sutura de seda estéril 5/0 sob a artéria. Corte a sutura ao meio e amarre com segurança os dois comprimentos da sutura para ligar a artéria, deixando pelo menos dois milímetros entre os nós. Transecte a artéria carótida esquerda entre as suturas, tomando o cuidado de deixar o nervo intacto e repetir a dissecção à direita.
Ligabilmente ligar a artéria carótida direita com uma única gravata umbilical de 1/8 polegadas. E feche a ferida com clipes de pele cirúrgicos. Em seguida, deixe o animal se recuperar em um banho de água controlado pela temperatura por pelo menos trinta minutos com monitoramento antes da hipóxia.
Para tratamento de hipóxia sequencial, hiperoxia e hipóxia, coloque os animais no grupo de lesões em uma câmara hermética dentro de um banho de água. Monitore continuamente a concentração de oxigênio dentro da câmara, bem como a temperatura retal em pelo menos um animal sentinela. Lave a câmara com 9% de oxigênio umidificado e 91% de nitrogênio e mantenha uma taxa de fluxo de três a cinco litros por minuto, dependendo do tamanho da câmara.
Uma vez que a concentração de oxigênio na câmara tenha atingido 9%, continue a entrega por trinta minutos. No final do tratamento de hipóxia, mude o fornecimento de gás para 80% de oxigênio umidificado e 20% de nitrogênio. Após trinta minutos de hiperoxia, abra a câmara para permitir que ela atinja mais rapidamente a normoxia, equilibrando-se com o ar da sala, antes de selar a câmara e lavar com 9% de oxigênio umidificado novamente.
Monitore continuamente todos os animais durante esta segunda rodada de hipóxia, tomando nota de todos os animais que exibem bradia. Uma vez que a concentração de oxigênio na câmara tenha atingido 9%, continue o tratamento de hipóxia por trinta minutos. No final do tratamento, utilizou fórceps curvos para identificar e desamarrar a fita umbilical da artéria carótida direita.
Recue a ferida com clipes cirúrgicos de pele. Em seguida, devolva todos os kits para os jills por 60 minutos para enfermagem e recuperação. Ao final do período de recuperação, devolva os animais feridos aos banhos de água a 37 a 40 graus Celsius por seis horas, ajustando a temperatura da água conforme necessário, para manter as temperaturas retais de 36 a 37 graus Celsius.
Então, devolva kits para suas jills novamente. Após a colheita e fixação cerebral no ponto final experimental apropriado, coloque as pontas de uma pinça eletrônica nos aspectos dorsais e ventral de cada cérebro para medir a altura de cada cérebro ferido e não ferido. Coloque as pontas da pinça nas porções mais laterais dos lobos temporais para medir a largura de cada cérebro e pesar cada cérebro.
Use a pinça para medir a fissura longitudinal, todos os sulci desde o início e o fim da porção mais distinta do sulco correspondente, e todos os giros do aspecto mais amplo de cada giro correspondente. Em seguida, coloque uma ponta da pinça no ponto mais posterior da fissura longitudinal e a outra ponta da pinça na parte mais posterior do cerebelo para medir a quantidade de cerebelo exposto. Dos 34 animais de seis ninhadas expostos ao insulto neste estudo, cinco animais tiveram lesão moderada e quatro animais tiveram ferimentos graves.
Com o aumento da lesão, observa-se o estreitamento do gyri nos lobos temporais e/ou occipitais, com um encurtamento sulcul associado e ampliação da fissura longitudinal e áreas maiores de perda de tecido cístico nos animais mais gravemente feridos. Durante o período de teste de reflexo, os animais feridos apresentam um tempo mais lento para girar na tarefa de geotaxis negativos. Um tempo mais lento para girar para longe da borda na tarefa cliff aversão e um tempo mais lento para a direita.
Na passarela, animais feridos demonstram uma velocidade média semelhante aos controles, mas apresentam um grau significativamente maior de variação de velocidade durante cada corrida. A distância ajustada de peso entre as patas e as patas traseiras é significativamente maior em animais feridos, com menos pressão exercida por unidade de patas, através das quatro patas. No campo aberto, os animais feridos cobrem menos distância total, param com mais frequência e passam significativamente mais tempo no centro do campo e menos tempo nos cantos.
Aqui, podem ser observados mapas de calor representativos de controle e animais feridos. Tome cuidado para dissecar a artéria do nervo que acompanha e permitir o máximo de tempo de hipóxia possível. Essas etapas garantirão que a maioria dos animais sobreviva, ao mesmo tempo em que sofre uma lesão.
Após este procedimento, qualquer desfecho bioquímico, patológico ou comportamental pode ser avaliado, incluindo avaliações que normalmente são restritas a modelos de roedores de lesão cerebral.
