La primachina è un noto farmaco antimalaro. La determinazione del primachina nei fluidi biologici è spesso necessaria per valutare la farmacocinetica. Attualmente, le principali tecniche per la determinazione di Primaquine si basano su HPLC.
Le procedure di HPLC possono essere piuttosto complicate e dispendiose in termini di tempo. Quindi questo metodo offre un modo semplice per il rilevamento rapido di Primaquine. Questo metodo Griess è potenzialmente il modo più semplice ed economico per la quantificazione di Primaquine.
Inoltre, questo metodo può offrire possibilità di rilevamento di Primaquine ad occhio nudo senza il requisito di alcuna apparecchiatura. Oltre ai campioni di siero e urine, questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per determinare quantitativamente la primachina nelle formulazioni farmaceutiche, ad esempio la determinazione del Primaquine in compresse per il controllo di qualità della produzione. A dimostrare la procedura saranno la signorina Wu Yalan e Wu Shengjun, due studentesse laureate del mio laboratorio.
Iniziare sciogliendo 0,1 millimoli di anilina e bifosfato di primachina in 10 millilitri di soluzione di acido fosforico al 5% in un pallone inferiore marrone da 25 millilitri. Mettere il pallone su un bagno di ghiaccio e aggiungere una barra di agitazione. Quindi metti il bagno di ghiaccio su una piastra di agitazione.
Sciogliere 6,9 milligrammi di nitrato di sodio e un millilitro di acqua raffreddata e aggiungerlo al pallone per quanto riguarda la goccia. Rimuovere il bagno di ghiaccio e mantenere la miscela di reazione mescolando a temperatura ambiente. Monitorare la reazione con una cromatografia a strato sottile rivestita di gel di silice o una piastra TLC, utilizzando una miscela di metanolo diclorometano come eluente.
Il prodotto azoico presenta macchie colorate sulla piastra TLC. Interrompere la reazione quando le macchie pmq scompaiono. Regolare il pH della miscela di reazione a maggiore di 10 aggiungendo soluzione di idrossido di sodio a un bagno di ghiaccio.
Quindi, utilizzare un imbuto di separazione da 50 millilitri per estrarre la miscela tre volte con 20 millilitri di acetato di etile per estrazione. Al termine, combinare e concentrare la fase organica sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante. Purificare i residui utilizzando la cromatografia flash con gel di silice in fase inversa sotto pressione normale.
Quindi, asciugare la soluzione per liofilizzazione per ottenere il prodotto azoico desiderato. Per misurare gli spettri di assorbimento uv vis, sciogliere l'azo puro in acqua distillata o acido fosforico al 5% e utilizzare lo spettrofotometro per registrare gli spettri di assorbimento a temperatura ambiente. Per misurare l'assorbimento del PMQ, iniziare sciogliendo la 4-metossianilina in cloruro di idrogeno molare 0,2 per una soluzione di anilina millimolare da 200 millimolare.
Quindi sciogliere il nitrito di sodio in acqua distillata per ottenere cinque soluzioni millimolari. Mantenere le soluzioni a quattro gradi Celsius. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di anilina a una piastra da 96 porri.
Quindi aggiungere 50 microlitri del campione contenente PMQ e mescolarlo con l'anilina. Aggiungere 50 microlitri della soluzione di nitrito di sodio alla piastra e mescolare il contenuto mediante pipettazione. Mantenere la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti, quindi misurare l'assorbanza della soluzione a 504 nanometri.
Esportare i dati come file di foglio di calcolo per ulteriori analisi. Per costruire una curva di calibrazione per le misurazioni del PMQ nei campioni di urina, preparare soluzioni PMQ nelle urine sintetiche a concentrazioni pari a zero, uno, due, cinque, 10, 20, 50, 100 e 200 micromolari. Preparare la reazione di rilevamento PMQ e misurare l'assorbanza come descritto in precedenza.
Quindi generare una curva di calibrazione basata sull'assorbanza di 504 nanometri e sulle concentrazioni di PMQ. Sottrarre i valori di assorbanza dei campioni senza PMQ dalle misurazioni di prova, ed eseguire un adattamento lineare per generare un'equazione lineare y uguale a x più b, dove y è l'assorbanza e la tensità, e x è la concentrazione di PMQ. Per costruire una curva di calibrazione per la misurazione del PMQ in campioni di siero umano, preparare soluzioni PMQ nel siero umano con concentrazioni di PMQ pari a zero, uno, due, cinque, 10, 20, 50, 100 e 200 micromolari.
Preparare la reazione PMQ. Misurare l'assorbanza e costruire la curva di calibrazione come descritto in precedenza. Aggiungere sei millilitri da sette a uno esano acetato di etile in due millilitri di siero contenente PMQ in un tubo di centrifuga da 15 millilitri.
Aggiungere 100 microlitri di due soluzioni molari di idrossido di sodio al sistema di estrazione e vortice il tubo per 30 secondi. Quindi, raccogliere lo strato organico e concentrarlo con un evaporatore rotante sotto vuoto. Sciogliere il residuo in 200 microlitri di acqua distillata e filtrare attraverso una membrana a forma di disco delle dimensioni di 220 nanometri per rimuovere i componenti lipidici insolubili.
Costruire la curva di calibrazione per PMQ in acqua distillata, quindi preparare una reazione di rilevamento con la soluzione estratta in una piastra da 96 po', come descritto in precedenza, e misurare l'assorbanza. Quindi, determinare la concentrazione di PMQ in base all'equazione lineare dalla curva di calibrazione. Le condizioni di reazione sono state ottimizzate utilizzando varie aniline da accoppiare con PMQ attraverso la reazione di Griess.
Sono stati effettuati calcoli teorici e i risultati sono stati in buoni accordi con le misurazioni ottiche. È stato determinato che la 4-metossianilina era ottimale per la reazione di rilevamento del PMQ, grazie alle sue buone prestazioni e velocità di reazione, solubilità del prodotto e stabilità. Inoltre, il prodotto azoico per la 4-metossianilina è di colore rosso, che è facile da distinguere ad occhi nudi.
Sono stati testati gli effetti del pH sull'assorbimento UV del prodotto azoico e sulle soluzioni PMQ. Mentre l'aumento del pH da 1,0 a 7,0 non cambia l'assorbanza, il pH di base ha un effetto significativo. Sono state costruite curve di taratura per il rilevamento del PMQ nei campioni di urina e siero.
Una relazione lineare è stata trovata quando il PMQ varia da zero a 200 micromolari nelle urine e da 10 a 200 micromolari nel siero. Per simulare un siero contenente PMQ reale, il PMQ è stato aggiunto nel siero umano a 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 concentrazioni micromolari. Utilizzando questo protocollo, le concentrazioni recuperate sono risultate essere 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 e 1,78 micromolari, con conseguente recupero del 90% per concentrazioni superiori a 0,5 micromolari.
Va notato che il tempo in cui la reazione raggiunge la sua intensità satura dipende dalla temperatura. Normalmente, da 10 a 20 minuti è sufficiente per una temperatura compresa tra 20 e 30 gradi centigradi. Tuttavia, per concludere il nostro esempio di chimica griess per il rilevamento dei primaquini.
Un design simile è adatto anche per altre molecole rilevanti che hanno una reattività chimica simile al primachina.
