Il nostro nuovo protocollo ci permette di visualizzare le strutture cellulari in 3D usando la tomografia computerizzata a raggi X. E lo facciamo macchiando il tessuto con eosina e in questo modo rendere visibile il citoplasma. Oltre alle applicazioni mediche e alla ricerca, pensiamo anche che il nostro metodo possa essere applicato in biologia come, ad esempio, la ricerca zoologia o la biologia dello sviluppo.
La tecnica è relativamente semplice, molto veloce e adatta anche per campioni di tessuto più grandi. Pensiamo che il nostro approccio combinato con la microtografia a raggi X possa essere integrato nel flusso di lavoro clinico e quindi aiutare i patologi a prendere decisioni migliori. Inizia fissando i campioni di tessuti molli.
Riempire un tubo di centrifuga da 50 millilitri con una soluzione fissante contenente 9,5 millilitri di formaldeide al 4% e 0,5 millilitri di acido acetico glaciale. Aggiungere il campione di tessuto molle al tubo di centrifuga e refrigera per 24-72 ore. Dopo la refrigerazione lavare il campione di tessuto molle con soluzione DPBS per un'ora.
Quindi macchiare il campione posizionandolo in due millilitri di soluzione di colorazione Eosin Y e incubarlo su una piastra tremante orizzontale per 24 ore. Il giorno successivo eseguire con cura il campione di tessuti molli dal contenitore del campione e rimuovere l'agente di colorazione in eccesso con carta velina di cellulosa. Posizionarlo in un contenitore conico sopra una fase di vapore di etanolo per lo stoccaggio e l'ulteriore utilizzo.
Preparare un portacampioni appropriato per montare il campione di tessuti molli secondo le indicazioni manoscritte e garantire una vestibilità aderente per evitare che il campione si muova durante le misurazioni della TC a raggi X. Una volta che l'adesivo si è indurito e il portacampioni è pronto per l'uso, trasferire il rene del topo nel tubo di centrifuga intatto che contiene alcune gocce di 70% di etanolo nella parte inferiore. Posizionare il campione montato nello scanner CT a raggi X.
Dopo aver allineato attentamente il campione, scegliere i parametri di acquisizione per la migliore qualità dell'immagine. Per i dati micro CT presentati, acquisire la scansione ad una tensione di picco di 50 kilovolt e una corrente di 3,5 watt utilizzando proiezioni 1601 equamente distribuite su 360 gradi. Quindi utilizzare i dati micro CT della scansione panoramica per selezionare l'area di interesse per la TAC ad alta risoluzione.
Preparare volumi di interesse del campione di tessuto molle tagliarlo in pezzi molto piccoli di circa 0,5 millimetri di lunghezza del bordo utilizzando un bisturi e un microscopio stereo. Se si utilizza un rene di topo, tagliarlo a due metà lungo l'asse più lungo. Prendi la metà e prepara diverse regioni anatomiche come una corteccia renale e un midollo renale.
Trasferire i piccoli pezzi in una nuova piastra di Petri per la disidratazione. Disidratare i campioni utilizzando una serie di soluzioni di etanolo secondo le indicazioni manoscritte, eseguendo ogni fase di disidratazione per un'ora. Trasferire i campioni disidratati nella capsula microporosa e chiuderli.
Tenere i campioni a contatto con il 100% di etanolo in ogni momento. Quindi punto critico asciugare i piccoli pezzi di tessuto. Una volta preparati i campioni di tessuto, conservarli in una nuova piastra di Petri conservata in un essiccatore prima di un ulteriore utilizzo.
Montare i pezzi di tessuto su un supporto campione appropriato garantendo una vestibilità aderente. Per una supercolla renale del topo i pezzi a un portacampioni utilizzando un microscopio stereo. Dopo un attento allineamento del campione, scegliere i parametri di acquisizione per la migliore qualità di imaging.
Per i dati nano-CT presentati, acquisire proiezioni ad una tensione di picco di 60 kilovolt con proiezioni 1599 equamente distribuite su 360 gradi e una dimensione voxel di circa 400 nanometri. Questo protocollo è stato utilizzato per la visualizzazione 3D delle strutture microscopiche dei tessuti di un rene di topo. Le misurazioni microTC a bassa risoluzione hanno permesso una panoramica dell'intero organo e hanno contribuito a identificare i volumi di interesse per le misurazioni ad alta risoluzione.
Lo stesso rene del topo è stato utilizzato per ottenere dati micro CT ad alta risoluzione. Si ottiene una visione più dettagliata delle strutture anatomiche come la corteccia, il midollo esterno e il midollo interno, tra gli altri. Un volume di rendering di interesse mostra la regione del midollo e una sezione virtuale attraverso la nave.
La nano-TC è stata utilizzata per ottenere una visione dettagliata del campione di rene a livello cellulare. Un piccolo pezzo di tessuto ottenuto dall'intero rene del topo è stato usato per immaginire gli arti ascendenti spessi dell'anello di Henle con una dimensione voxel di circa 400 nanometri. È stato condotto uno studio comparativo per garantire che la nano-TC sia pienamente compatibile con l'istopatologia.
L'approccio di imaging multimodale ha confermato i risultati ottenuti con entrambi i metodi. Durante la fase di incubazione è fondamentale che il campione sia completamente circondato dalla soluzione di colorazione. Anche quando si esegue l'imaging a raggi X CT, il fatto più importante è garantire la stabilità del campione durante l'acquisizione dei dati.
I campioni di tessuti molli che sono stati analizzati con il nostro protocollo possono essere ulteriormente analizzati utilizzando la tecnica istologica standard come la controsottenimento dell'ematossilina. Il nostro protocollo di colorazione contribuirà in modo sostanziale a far avanzare l'istologia dei raggi X 3D. La ricerca medica trarrà particolare beneficio da questa tecnica di imaging 3D non distruttiva.
