La tecnica di registrazione bagno era la prima volta da Fricke (1984) 8 e Beall et al. (1990) 9 per misurare i campi elettrici generati durante la coda-flip. La tecnica fu poi modificato e migliorato nel laboratorio del Dr. Donald Edwards (Georgia State University) dal suo ex studente laureato Dott. A. Fadi Issa e il suo ex socio postdoctoral Dr. Jens Herberholz. Ulteriori perfezionamenti sono stati fatti e nuove applicazioni di ricerca sono stati testati in laboratorio del Dr. Jens Herberholz presso l&#39;Università del Maryland. Vorrei ringraziare il mio collega Dott. David Yager per avermi permesso di utilizzare il suo sistema ad alta velocità video e la mia ricerca assistenti David Rotstein e William Liden per un aiuto con gli esperimenti.

Parte 1: camera di registrazione <ol><li> La camera di registrazione è di forma rettangolare ed è composta da sottili pareti di vetro. Dimensioni camera sono 8,5 cm x 2 cm x 5 cm (lunghezza x larghezza x altezza) per gli animali di 2,5-3,5 lunghezza totale cm (misurata dal rostro fino telson). Vedi fig. 1 per un esempio di una camera usata nei nostri esperimenti. </li><li> In alternativa, camere di registrazione può essere fatta da altri materiali (ad esempio, non tossico in plastica trasparente). Dimensioni Camere possono variare in base alla procedura sperimentale e le camere devono essere personalizzati per ogni serie sperimentale. Per ottenere risultati ottimali, la dimensione della camera deve essere il più piccolo possibile senza frenare gli animali nel loro comportamento naturale. Come regola generale, la lunghezza e la larghezza della camera non deve essere più di tre volte le dimensioni dell&#39;animale. </li></ol> Parte 2: elettrodi bagno e filo di terra <ol><li> Una coppia di elettrodi di registrazione e un elettrodo di massa vengono utilizzati. Elettrodi sono fatti di filo di rame isolato (26 AWG con isolamento 0,25 mm). Una estremità degli elettrodi bagno è collegato ad un amplificatore extracellulare (AM Sistemi 1700; vedi sotto) e 0,5 - 1,0 mm di isolamento sono tolto gli altri fini. Il cavo di terra è collegato alla terra dell&#39;amplificatore o di qualsiasi altra attrezzatura a terra e 2-3 cm di isolamento è tolto l&#39;altra estremità. </li><li> Elettrodi bagno e filo di terra sono attaccate alle pareti interne della camera di registrazione con colla non tossica. Elettrodi di registrazione sono posizionati centralmente su entrambi i lati corti della camera e di fronte gli uni agli altri (Fig. 1). </li><li> Elettrodo di massa è posizionato su un lato lungo della camera di registrazione perpendicolare agli elettrodi di registrazione (Fig. 1). </li><li> Camera è riempita con acqua deionizzata. I migliori risultati si ottengono con acqua ad alta resistenza (~ 18 MΩ). </li></ol> Parte 3: registrazioni elettrodo Bagno <ol><li> Uscite da elettrodi di registrazione sono amplificati (1000x) da un amplificatore extracellulare (Sistemi AM; 1700 Model). Segnale dal elettrodi di registrazione è filtrato utilizzando una combinazione di bassa frequenza (&lt;100 Hz) e alta frequenza di cut-off (&gt; 5 KHz). Segnale viene poi collegato ad un dispositivo di commutazione e una scheda di acquisizione dati (National Instruments). Dati digitalizzati sono registrati, memorizzati e analizzati utilizzando software di acquisizione dati (Photron Strumenti di movimento). </li><li> In alternativa, segnale amplificato da elettrodi di registrazione possono essere digitalizzati con altri convertitori analogico-digitale (ad esempio, MDS tecnologie di analisi; Digidata 1440) prima che i dati digitalizzati vengono registrati utilizzando altri disponibili in commercio software di acquisizione dati (ad esempio, MDS tecnologie di analisi; Axoscope). </li></ol> Parte 4: Sonda Stimolare <ol><li> Una sonda stimolante è costituito da una pipetta di vetro (14 cm di lunghezza) dotato di una coppia di elettrodi filo sottile. Punte degli elettrodi sono esposti (0,2 mm) per produrre un segnale elettronico quando l&#39;animale viene toccato dalla sonda. Questo permette di misurare il tempo esatto di stimolazione. </li><li> Uscite dalla sonda stimolanti sono amplificati (1000x) da un amplificatore extracellulare (Sistemi AM; 1700 Model). Il segnale viene filtrato utilizzando una combinazione di bassa frequenza (&lt;100 Hz) e alta frequenza di cut-off (&gt; 5 KHz). Il segnale viene poi collegato ad un dispositivo di commutazione e di una scheda di acquisizione dati (National Instruments). Dati digitalizzati sono registrati, memorizzati e analizzati utilizzando software di acquisizione dati (Photron Strumenti di movimento). </li></ol> Parte 5: Le registrazioni video <ol><li> Una telecamera ad alta velocità video (Fastcam PCI-X 1280, Photron) è posizionato perpendicolarmente alla camera di registrazione per fornire una vista laterale. Livello di luminosità all&#39;interno della camera di registrazione deve essere regolato per fornire i migliori risultati, per esempio utilizzando un illuminatore a collo d&#39;oca o di altre fonti luminose attivabili. </li><li> Ad alta velocità videografia è combinato e sincronizzato con le registrazioni elettronica utilizzando un breakout box e acquisizione dati di bordo (National Instruments). Segnale amplificato dagli elettrodi bagno è collegato al breakout box e scheda di acquisizione dati tramite cavi BNC. Un interruttore esterno a mano trigger avvia l&#39;acquisizione sincronizzata video e dati. </li></ol> Parte 6: Procedura sperimentale <ol><li> Un singolo animale viene introdotto nella camera e ha permesso di acclimatare per 5 minuti. Fuga di coda ribalta sono attivati ​​da rubinetti singoli di diversa intensità alla testa o all&#39;addome, rispettivamente. L&#39;intensità dei rubinetti è controllata dallo sperimentatore. Ogni fuga di coda flip è registrato con video ad alta velocità ad un frame rate di 1000 punti f / sec, e dei dati dei potenziali campo elettronico sono registrati a 25 kHz. Inizio del bagno e la registrazione video è iniziata da interruttore manuale su una scatola grilletto. Tempo di registrazione è determinato dalla percentuale di cornice scelta (ad esempio, 1000 f / sec = 4 secondi il tempo di registrazione totale). Post e pre-trigger tempi di registrazione possono essere selezionati. </li><li> None: registrazioni di elettrodi da bagno deve essere verificata una volta per ogni specie testate, combinando registrazioni elettrodo bagno con altri metodi disponibili registrazioni. In gamberi, una coppia di elettrodi d&#39;argento può essere impiantato chirurgicamente in tutto il cordone nervoso ventrale. Stimoli abbia coda flip fuga può essere applicato e registrare tracce elettroniche di elettrodi impiantati e bagno può essere paragonato. </li><li> Fuga coda-flip comportamento e le corrispondenti attività neurale possono essere registrati in una varietà di contesti diversi, ad esempio, in risposta alle minacce visive, durante gli attacchi dei predatori, o durante gli incontri agonistici di due gamberi. Dimensioni della camera, modalità di registrazione, ecc deve essere regolata di conseguenza (vedi Discussione). </li></ol> Parte 7: Analisi dei dati <ol><li> Singoli fotogrammi video vengono analizzati utilizzando software di movimento (Photron). Tracce elettroniche sono utilizzate per identificare il tipo di circuito neurale che è stato attivato da ogni stimolo. Dati video viene confrontato con sincronizzato registrazioni fisiologiche per determinare il movimento dell&#39;animale e il circuito di attivazione neurale. Ogni circuito attivato produce una caratteristica firma elettronica (vedi risultati rappresentante). </li><li> Latenza tra sonda a contatto e la risposta neurale / muscolari sono calcolati per ogni esperimento, misurando il ritardo tra l&#39;inizio del segnale della sonda e l&#39;inizio del segnale registrato con gli elettrodi bagno. </li></ol> Parte 8: I risultati rappresentativi Una serie di singoli ad alta velocità fotogrammi video e le corrispondenti registrazioni di campo elettrico per la fuga di coda-flip in risposta ad uno stimolo tattile consegnato alla testa o coda di un gambero giovanile (Fig. 2). Fig. 2A: forte stimolo tattile alla testa evocato una coda-flip controllato dal circuito mediale gigante. Il picco registrato del neurone gigante (asterischi) e la deformazione grande fasica che segue consente l&#39;identificazione non ambigua della coda-flip come mediata da attività neurone gigante. Il movimento all&#39;indietro indicato nella traccia video determina l&#39;identità del circuito neurale attivato (MG). Fig. 2B: Coda-flip mediata dal circuito gigante laterale dopo un forte stimolo tattile è stato applicato alla coda. Movimento verso l&#39;alto e in avanti si vede nel video tracce insieme alla traccia sincronizzato elettronica visualizzando il gigante e il grande picco, deflessione fasica iniziale determina l&#39;identità del circuito neurale attivato (LG). Fig. 2C: Coda-flip controllata dal gigante non circuiti. Uno stimolo tattile più graduale è stato consegnato al torace dell&#39;animale. Mentre il movimento catturato in video non consentano l&#39;identificazione univoca del circuito attivato, la registrazione elettronica manca un picco gigante e si compone di deviazioni molto più piccoli che identifica il circuito attivato (non-G). Fig. 3: misure di latenza per tutti e tre i tipi di fuga coda-flip. Tempo di contatto tra la sonda e la risposta fisiologica è stata misurata per sette animali. Giant-mediata coda ribalta sono suscitato notevolmente più veloce rispetto ai non-gigante coda-flip. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig1.jpg" alt="" /> Figura 1: Un esempio per una camera di registrazione utilizzato nei nostri esperimenti per gli animali di 2,5-3,5 cm di lunghezza totale. Gli elettrodi bagno sono incollati ai lati opposti della camera, mentre il filo di terra è collegato al lato lungo della camera e perpendicolare agli elettrodi bagno. Figura 2: fotogrammi video singolo registrato a 1000 registrazioni f / sec e corrispondente elettronico per tre diversi tipi di stimolazione. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2A.jpg" alt="" /> A) Un forte stimolo tattile è stato consegnato alla testa dell&#39;animale e suscitato un gigante mediale (MG) ​​mediata coda-flip. Sei video-frame vengono visualizzate sulla sinistra. Traccia di registrazione dalla sonda utilizzata per toccare l&#39;animale è mostrata in grigio, il punto di contatto è indicato dalla freccia nera. Traccia di registrazione ottenuti con gli elettrodi bagno è mostrata in blu. L&#39;inserto mostra la piccola punta assone gigante che precede le grandi deviazioni fasica. Barre di grigio corrispondono al video-frame mostrato a sinistra. Il primo movimento notevole di coda del gambero è verificato a telaio # 3, sette millesimi di secondo dopo il contatto con la sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2B.jpg" alt="" /> B) Un forte stimolo tattile è stato consegnato alla coda dell&#39;animale e suscitato un gigante laterale (LG) mediata coda-flip. Sei video-frame vengono visualizzate sulla sinistra. Traccia di registrazione dalla sonda utilizzata per toccare l&#39;animale è mostrata in grigio, il punto di contatto è indicato dalla freccia nera. Traccia di registrazione ottenuto con laelettrodi bagno è mostrato in rosso. L&#39;inserto mostra la piccola punta assone gigante che precede le grandi deviazioni fasica. Barre di grigio corrispondono al video-frame mostrato a sinistra. Il primo movimento notevole di coda del gambero è verificato a telaio # 3, otto millesimi di secondo dopo il contatto con la sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig2C.jpg" alt="" /> C) Uno stimolo debole e graduale tattile è stato consegnato alla testa dell&#39;animale e suscitato un non-gigante (Non-G) mediata coda-flip. Otto video-frame vengono visualizzate sulla sinistra. Traccia di registrazione dalla sonda utilizzata per toccare l&#39;animale è mostrata in grigio, il punto di contatto è indicato dalla freccia nera. Traccia di registrazione ottenuti con gli elettrodi bagno appare in bianco. La traccia non ha il potenziale gigante punta, la grande deviazioni iniziale ed è costituito da potenziali di ampiezza molto più piccola. Luce barre grigie corrispondono al video-frame mostrato a sinistra. Il primo movimento notevole di coda del gambero è verificato a telaio # 6, 115 millesimi di secondo dopo il primo contatto con la sonda. <img src="/files/ftp_upload/1297/Fig3.jpg" alt="" /> Figura 3: misure di risposta di latenza per sette diversi animali di entrambi i sessi e di dimensioni simili (lunghezza media ± stdv: 3.2 cm ± 0,2 cm, misurati dal rostro fino telson). MG (barra blu) e LG (barra rossa) tail-flip hanno latenze di risposta significativamente più breve di coda-flip mediata dalla non-G (barra nera) circuiti. Medie e deviazioni standard sono mostrati. Bar con la stessa lettera non differiscono significativamente tra loro (rank test Wilcoxon Signed per il confronto a coppie, p &lt;0,05).

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	<li>Herberholz, J., Issa, F. A., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+neural+circuit+activation+and+behavior+during+dominance+hierarchy+formation+in+freely+behaving+crayfish.">Patterns of neural circuit activation and behavior during dominance hierarchy formation in freely behaving crayfish.</a> J. Neurosci. 21, 2759-2767 (2001).</li><li>Herberholz, J., Sen, M. M., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behavior+and+escape+circuit+activation+in+juvenile+crayfish+during+prey-predator+interactions.">Escape behavior and escape circuit activation in juvenile crayfish during prey-predator interactions.</a> J. Exp. Biol. 207, 1855-1863 (2004).</li><li>Liden, W. H., Herberholz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+neural+responses+of+juvenile+crayfish+to+moving+shadows.J.">Behavioral and neural responses of juvenile crayfish to moving shadows.J.</a> Exp. Biol. 211, 1355-1361 (2008).</li><li>Finley, L. A., Macmillan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+field+potentials+during+different+tailflip+behaviours+in+crayfish.">An analysis of field potentials during different tailflip behaviours in crayfish.</a> Mar. Freshw. Behav. Physiol. 35, 221-234 (2002).</li><li>Eaton, R. C., Lee, R. K. K., Foreman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mauthner+cell+and+other+identified+neurons+of+the+brainstem+escape+network+of+fish.">The Mauthner cell and other identified neurons of the brainstem escape network of fish.</a> Prog. Neurobiol. 63, 467-485 (2001).</li><li>Canfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+voluntary+C-bends+may+be+Mauthner+neuron+initiated.">Some voluntary C-bends may be Mauthner neuron initiated.</a> J. Comp. Physiol. A. 193, 1055-1064 (2007).</li><li>W&#246;hl, S., Schuster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+predictive+start+of+hunting+archer+fish:+a+flexible+and+precise+motor+pattern+performed+with+the+kinematics+of+an+escape+C-start.">The predictive start of hunting archer fish: a flexible and precise motor pattern performed with the kinematics of an escape C-start.</a> J. Exp. Biol. 210, 311-324 (2007).</li><li>Fricke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+habituation+in+the+crayfish+due+to+selective+weakening+of+electrical+synapses.">Development of habituation in the crayfish due to selective weakening of electrical synapses.</a> Brain Res. 322, 139-143 (1984).</li><li>Beall, S. P., Langley, D. J., Edwards, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+escape+tailflip+in+crayfish+during+backward+walking+and+the+defense+posture.">Inhibition of escape tailflip in crayfish during backward walking and the defense posture.</a> J. Exp. Biol. 152, 577-582 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Non invasiva registrazioni di attività singolo neurone o l&#39;attivazione del circuito neurale sono difficili da ottenere negli animali sfrenato. Il metodo qui descritto fornisce un mezzo per identificare i pattern di attivazione neurale sottostante naturale comportamento. In passato, abbiamo utilizzato con successo questa tecnica per misurare i modelli di attività nei circuiti neurali escape di gamberi giovani durante la formazione di gerarchie di dominanza sociale 1, durante ...

recordings of neural circuit activation in freely behaving animals

Il rapporto tra modelli di attività neurale e corrispondente espressione comportamentale è difficile da stabilire negli animali sfrenato. Tradizionali metodi non invasivi richiedono soggetti di ricerca, almeno in parte frenato, e soltanto permettere l&#39;identificazione di un gran numero di neuroni attivati ​​contemporaneamente. D&#39;altra parte, piccoli ensemble di neuroni o di singoli neuroni possono solo essere misurato con cella singola registrazioni ottenute da preparati in gran parte ridotto. Dal momento che l&#39;espressione del comportamento naturale è limitata negli animali sobrio e sezionato, i meccanismi neurali alla base che controllano tali comportamenti sono difficili da identificare. Qui, vi presento un tecnica non invasiva che permette la misurazione fisiologica attivazione neurale circuito comportarsi liberamente gli animali. Utilizzando una coppia di elettrodi a filo all&#39;interno di una camera piena d&#39;acqua, gli elettrodi bagno registrare potenziali di campo nervose e muscolari generate da gambero giovanile durante le risposte di fuga naturale o sperimentalmente evocato. Le risposte fuga primario di gamberi sono mediate da tre diversi tipi di flip-coda che si muovono gli animali lontano dal punto di stimolazione. Ogni tipo di coda-flip è controllato da un proprio circuito neurale, le due risposte di fuga più veloce e potente richiedono l&#39;attivazione di diversi gruppi di neuroni comando di grandi dimensioni. In combinazione con osservazioni comportamentali, le registrazioni bagno elettrodo permettono l&#39;identificazione univoca di questi neuroni e dei circuiti neurali associate. Così l&#39;attività dei circuiti neurali alla base del comportamento in natura può essere misurata negli animali sfrenato e in diversi contesti comportamentali.

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Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Misurazioni non invasive di schemi di attività neurale nel comportarsi liberamente gli animali sono ottenuti combinando registrazioni neurofisiologiche con videografia ad alta velocità.

Le registrazioni di attivazione circuito neurale in Liberamente Comportarsi Animali

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.5K Views.  University of Maryland. Misurazioni non invasive di schemi di attività neurale nel comportarsi liberamente gli animali sono ottenuti combinando registrazioni neurofisiologiche con videografia ad alta velocità.

Video: Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we will guide you through the process of performing whole-cell recordings of light evoked currents of individual cells in the retinal slice preparation. We use the aquatic tiger salamander as an animal model. We begin by describing the dissection of the eye and show how slices are mounted for electrophysiological recordings. Once the slice is placed in the recording chamber, we demonstrate how to perform whole-cell voltage clamp recordings. We then project visual stimuli onto the photoreceptors in the slice to elicit light-evoked current responses. During the recording we perfuse the slice with pharmacological agents, whereby an 8-channel perfusion system allows us to quickly switch between different agents.  The retinal slice preparation is widely used for patch clamp recordings in the retina, in particular to study amacrine or bipolar cells, which are not accessible in a whole-mount preparation.

This video shows the process of whole-cell voltage clamp recordings in the retinal slice of the aquatic tiger salamander. We demonstrate the preparation of the slice as well as how to perform patch clamp recordings during visual stimulation of the retina.

A cellula intera Recordings of Light Evocati eccitatorio Correnti Synaptic nel Slice Retinal

We use the whole-cell patch clamp technique to study the synaptic circuitry that underlies visual information processing in the retina. In this video, we ...

Ricerca

Biologia

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no curative treatment available. Recent advances in stem cell biology have generated new hopes for the development of effective cell based therapies to treat these diseases. Transplantation of various types of stem cells labeled with fluorescent proteins into muscles of dystrophic animal models has been used broadly in the field. A non-invasive technique with the capability to track the transplanted cell fate longitudinally can further our ability to evaluate muscle engraftment by transplanted cells more accurately and efficiently.
In the present study, we demonstrate that in vivo fluorescence imaging is a sensitive and reliable method for tracking transplanted GFP (Green Fluorescent Protein)-labeled cells in mouse skeletal muscles. Despite the concern about background due to the use of an external light necessary for excitation of fluorescent protein, we found that by using either nude mouse or eliminating hair with hair removal reagents much of this problem is eliminated. Using a CCD camera, the fluorescent signal can be detected in the tibialis anterior (TA) muscle after injection of 5 x 105 cells from either GFP transgenic mice or eGFP transduced myoblast culture. For more superficial muscles such as the extensor digitorum longus (EDL), injection of fewer cells produces a detectable signal. Signal intensity can be measured and quantified as the number of emitted photons per second in a region of interest (ROI). Since the acquired images show clear boundaries demarcating the engrafted area, the size of the ROI can be measured as well. If the legs are positioned consistently every time, the changes in total number of photons per second per muscle and the size of the ROI reflect the changes in the number of engrafted cells and the size of the engrafted area. Therefore the changes in the same muscle over time are quantifiable. In vivo fluorescent imaging technique has been used primarily to track the growth of tumorogenic cells, our study shows that it is a powerful tool that enables us to track the fate of transplanted stem cells.

Tracking Dynamics of Muscle Engraftment in Small Animals by In Vivo Fluorescent Imaging

We describe an in vivo fluorescence imaging protocol to monitor muscle regeneration by GFP-labeled myoblasts after transplantation into skeletal muscles of both healthy and dystrophic mice. This protocol can be adapted to study muscle regeneration by transplantation of other types of cells and in other muscular conditions as well.

Monitoraggio Dinamica di attecchimento muscolare nei piccoli animali da In Vivo Fluorescente Imaging

Muscular dystrophies are a group of degenerative muscle diseases characterized by progressive loss of contractile muscle cells. Currently, there is no ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Misure di Cuore e Tariffe ventilatoria a muoversi liberamente gamberi di fiume

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

RhoC GTPase Activation Assay

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase. Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed. However, RhoC GTPase is expressed in metastatic cancer cells at relatively low levels. Therefore, few RhoC-specific reagents have been developed. We have adapted a Rho activation assay to detect RhoC GTPase. This technique utilizes a GST-Rho binding domain fusion protein to pull out active RhoC GTPase. In addition, we can harvest total protein at the beginning of the assay to determine levels of total (GTP and GDP bound) RhoC GTPase. This allows for the determination of active versus total RhoC GTPase in the cell. Several commercial versions of this procedure have been developed however, the commercial kits are optimized for RhoA GTPase and typically do not work well for RhoC GTPase. Parts of the assay have been modified as well as development of a RhoC-specific antibody.

This protocol utilizes a pull down assay to determine the levels of active RhoC GTPase within cells.

RhoC GTPasi attivazione di analisi

RhoC GTPase has 91% homology to RhoA GTPase.  Because of its prevalence in cells, many reagents and techniques for RhoA GTPase have been developed.  ...

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology used in electrophysiology. The same equipment is used in the membrane model as on live preparations. Some properties of an isolated nerve cord are investigated: nerve action potentials, recruitment of neurons, and responsiveness of the nerve cord to environmental factors.

This is a demonstration of how biological membranes can be understood using electrical models. We also demonstrate procedures for recording action potentials from the ventral nerve cord of the crayfish for student orientated laboratories.

Modellazione membrane biologiche con Circuiti e misurazione dei segnali elettrici negli assoni: Esercizi di laboratorio per studenti

This is a demonstration of how electrical models can be used to characterize biological membranes. This exercise also introduces biophysical terminology ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

Isolamento e In vitro Attivazione di Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Attivazione di apoptosi da Microiniezione citoplasmatici del Citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Esecuzione Lavage vaginale, di colorazione viola di cristallo, e la valutazione citologica vaginale per l&#39;identificazione ciclo estrale Staging mouse

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...