Qui dimostriamo come utilizzare il sensore FRET sensibile all'ATP ATeam 1.03 YEMK per misurazioni dinamiche dei cambiamenti nei livelli di ATP neuronale e astrocitico nelle fette ippocampali del topo coltivate organotipicamente. Il principale vantaggio di questa tecnica è che si può studiare il metabolismo energetico nel tessuto cerebrale vivente in un ambiente controllato, un ambiente con alti livelli di espressione del sensore. Questa tecnica può aiutare a ottenere informazioni sui pathomechanismi, sulle malattie sottostanti o sui danni cerebrali, ad esempio, causati dalla privazione di energia, come l'ictus ischemico.
In linea di principio può essere utilizzato per studiare i livelli di ATP, non solo nel tessuto cerebrale, ma anche in altri organi. Per eseguire con successo questo esperimento, è essenziale eseguire tutti i passaggi coinvolti nella coltura del tessuto estremamente attenta e per mantenere la sterilità. Inoltre, è richiesta una certa conoscenza dell'imaging fluorescente cellulare.
La movimentazione dei tessuti nell'approccio più sofisticato e una visualizzazione è fondamentale per comprendere le procedure appropriate. Lo stesso vale per gli esperimenti di imaging. A dimostrare la procedura saranno Rodrigo Lerchundi, un postdoc, e Na Huang, uno studente magistrale del laboratorio.
In una piastra di Petri ghiacciata piena di ACSF, posizionare il cervello su una membrana filtrante. Separare gli emisferi ed eseguire un taglio parasagittale con un angolo di 45 gradi. Fissare un emisfero allo stadio del tessuto Vibratome con supercolla e trasferire immediatamente il blocco di tessuto al bagno Vibratome contenente ACSF ghiacciato bolleto con anidride carbonica al 5% e 95% di ossigeno.
Allineare il tessuto nel bagno Vibratome. Mantenere il secondo emisfero in ACSF ghiacciato fino all'affettamento. Regolare il Vibratome per tagliare le fette a 250-400 micrometri.
Dopo aver tagliato la fetta, identificare la formazione ippocampale in base al suo tipico aspetto morfologico e isolarla usando aghi ipodermici, mantenendo la parte della corteccia cerebrale adiacente all'ippocampo. Posizionare la fetta su una rete in ACSF, riscaldata a 34 gradi Celsius e bollata con 5% di anidride carbonica e 95% di ossigeno fino a quando tutte le fette non vengono raccolte. Trasferire le fette nell'armadio di flusso laminare per continuare in condizioni sterili.
Con una pipetta Pasteur invertita, sterile e in vetro, trasferire delicatamente le fette dall'ACSF in una delle piastre petri pre-riscaldate riempite con soluzione di sale sterile di Hanks. Cambiare la pipetta e trasferire le fette nel secondo piatto di coltura. Ripetere il processo cinque volte nel complesso.
Trasferire il meno HBSS possibile sulle seguenti piastre di coltura. Utilizzando una pipetta, posizionare delicatamente una fetta alla volta sulla parte superiore dell'inserto delle impostazioni cultura. Evitare turbolenze nella pipetta e attendere che la fetta scenda sulla punta della pipetta Pasteur.
Ripetere il processo per ogni sezione. Posizionare due fette su una membrana. Rimuovere con cura qualsiasi soluzione Hank in eccesso dalla parte superiore dell'inserto utilizzando una punta fine.
Mantenere le colture in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica e 37 gradi Celsius fino al giorno dell'esperimento. Sostituire il supporto ogni due o tre giorni. Senza toccare il tessuto, applicare 0,5 microlitri del vettore diluito direttamente sulla parte superiore di ogni fetta.
Infine, riposizionare le fette nell'incubatrice e mantenerle lì per almeno altri sei giorni. Poco prima di iniziare un esperimento, trasferire un inserto contenente fette coltivate nel cappuccio sterile e posizionarlo in un piatto da 30 millimetri contenente un millilitro di mezzo di coltura di fette organotipiche o mezzo essenziale minimo. Posizionare il piatto sotto lo stereoscopio e mettere a fuoco sulla superficie della fetta.
Utilizzare due aghi ipodermici sterili per fare un breve taglio incrociato proprio sui bordi stretti di una fetta scelta e nello strato superiore senza danneggiare il tessuto sottostante. Per rimuovere la fetta preparata dall'inserto, tenere i bordi della membrana con una pinzetta e utilizzare un bisturi sterile per effettuare tagli dritti e paralleli alla membrana, formando un quadrato o un triangolo con la fetta al centro. Se l'inserto ospita fette aggiuntive, trasferirlo di nuovo nella piastra originale e nell'incubatore.
La tensione superficiale del mezzo impedirà la sua perdita sulla superficie della membrana. Preparare l'ACSF sperimentale e ottenere un pH di 7,4 gorgogliandolo con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica attraverso un tubo inserito collegato all'alimentazione di carbogeni per almeno trenta minuti. Mantenere la salina bollata durante l'intero esperimento.
Quindi accendere la sorgente luminosa fluorescente del monocromatore. Trasferire la coltura delle fette organotipiche nella camera sperimentale. Posizionare una griglia sopra la coltura delle fette organotipiche con il telaio verso il basso, non toccando la coltura, e i fili verso l'alto, toccando la membrana.
Posizionare la camera sul palco del microscopio e collegarla al sistema di perfusione. Accendere la pompa peristaltica a una portata da 1,5 a 2,5 millilitri al minuto. Assicurarsi che non vi sia alcuna perdita del sistema di perfusione.
Utilizzando la luce di trasmissione, mettere a fuoco la fetta coltivata e identificare l'area in cui devono essere eseguiti gli esperimenti. Prima di iniziare gli esperimenti di imaging, attendere almeno 15 minuti per consentire alle fette di adattarsi alle condizioni saline, quindi accendere la fotocamera e il software di imaging. Eccitare la proteina fluorescente donatrice a 435 nanometri.
Impostare il tempo di esposizione tra 40 e 90 millisecondi. Quindi inserire lo specchio dicroico e i filtri nell'unità beam splitter. Dividi l'emissione di fluorescenza a 500 nanometri con uno splitter di immagini di emissione e utilizza filtri passa banda a 482 più o meno 16 e 542 più o meno 13,5 nanometri per isolare ulteriormente la fluorescenza del donatore e dell'accettore.
Selezionare una regione di interesse apparentemente priva di fluorescenza cellulare per la sottrazione di fondo. Cerchia singole strutture di tessuto etichettato nell'immagine sullo schermo per creare ROM. Impostare la frequenza di acquisizione dell'immagine e il tempo di registrazione complessivo.
Per esperimenti superiori a 30 minuti, si consiglia una frequenza di acquisizione da 0,2 a 0,5 Hertz per prevenire la fototossicità. Successivamente, avviare la registrazione. Per indurre cambiamenti nell'ATP intracellulare, passare il tubo di perfusione dall'ACSF standard a una soluzione salina contenente inibitori metabolici, ad esempio la soluzione chimica di ischemia.
In alternativa, utilizzare una salina con elevata concentrazione di potassio a otto millimolari per imitare il rilascio di ioni di potassio dai neuroni attivi. Subito dopo le registrazioni, scambia l'ACSF sperimentale con aCSF bufferato da heap. Quindi trasferire la camera di registrazione contenente la coltura della fetta al microscopio a scansione laser confocale.
Prendi le immagini dello stack Z alla massima risoluzione Z possibile alla configurazione ottica data. In questo protocollo, dieci giorni dopo una trasduzione, i neuroni che esprimono ATeam 1.03 YEMK sono stati trovati ad alta densità nella neocorteccia di fette di tessuto coltivate a profondità fino a 50 micrometri sotto la superficie della fetta. Risultati comparabili sono stati raggiunti nell'ippocampo.
Per gli astrociti, ATeam 1.03 YEMK è stato espresso sotto il controllo del promotore umano della proteina acida fibrolaria gliale, e le fette organotipiche che esprimono ATeam 1.03 YEMK nei neuroni ippocampali selezionati ROM rappresentano i somata delle cellule piramidali. Dopo aver esposto la fetta a 5 millimolare di azide di sodio in assenza di glucosio extracellulare per un minuto, sono stati indotti cambiamenti opposti nell'intensità di emissione della coppia FRET. È stata osservata anche una diminuzione reversibile del rapporto FRET ATeam.
Il rapporto ATeam FRET a lungo termine in 14 cellule diverse in condizioni di base in neuroni e astrociti mostra che l'ATeam è un sensore affidabile e stabile. Si prega di notare che l'ischemia chimica ha portato al forte calo previsto del rapporto ATeam in entrambi i tipi di cellule alla fine di questo esperimento. Un aumento della concentrazione extracellulare di potassio da tre a otto millimolari per tre minuti non ha comportare un cambiamento rilevabile nei neuroni che esprimono ATeam 1.03 YEMK.
Al contrario, gli astrociti reagirono all'aumento del potassio extracellulare con un aumento reversibile del rapporto FRET ATeam, indicando un aumento dei livelli di ATP intracellulare. Ancora una volta, l'ischemia chimica ha causato una diminuzione immediata del rapporto ATeam, dimostrando che il sensore è in grado di rilevare cambiamenti nell'ATP. Quando si tenta l'imaging cellulare basato su FRET come descritto qui, è importante tenere presente che la produzione di fette di alta qualità nelle colture organotipiche è un passaggio chiave.
Inoltre, è necessaria un'attenta rimozione della cicatrice gliale e dell'imaging a livello di esperto. Seguendo questa procedura, si dovrebbe anche essere in grado di eseguire esperimenti incorporando diversi altri nanosensori basati su FRET per metaboliti cellulari. Ad esempio, quelli per glucosio o lattato.
Infine, ma non meno importante, va sottolineato che gli atti pertinenti per la protezione degli animali devono sempre essere rispettati. Ciò vale anche per le leggi efficaci che disciplinano la manipolazione di organismi geneticamente modificati.
