Burada, organotipik kültüre duyarlı fare hipokampal dilimlerinde nöronal ve astrositik ATP düzeylerindeki değişikliklerin dinamik ölçümleri için ATP'ye duyarlı FRET sensörü ATeam 1.03 YEMK'ı nasıl çalıştırabileceğimizi gösteriyoruz. Bu tekniğin en büyük avantajı, kişinin canlı beyin dokusunda enerji metabolizmasını kontrollü bir ortamda, yüksek sensör ifade seviyelerine sahip bir ortamda inceleyebilmektir. Bu teknik patomekanizmaları, altta yatan hastalıklar, ya da beyin hasarı, örneğin, enerji yoksunluğu neden, iskemik inme gibi anlayışlar kazanmaya yardımcı olabilir.
Bu, ilke olarak, ATP düzeyleri çalışmak için kullanılabilir, sadece beyin dokusunda, ama diğer organlarda da. Başarılı bir şekilde bu deneyi çalıştırmak için, son derece dikkatli doku culturing dahil tüm adımları gerçekleştirmek ve sterilite korumak için gereklidir. Ayrıca, hücresel floresan görüntüleme bazı bilgi gereklidir.
Doku işleme en sofistike yaklaşım ve bir görselleştirme uygun prosedürleri anlamak için hayati önem taşımaktadır. Aynı görüntüleme deneyleri için de geçerlidir. Prosedürü gösteren Rodrigo Lerchundi, bir postdoc ve Na Huang, laboratuvardan bir Master öğrenci olacaktır.
ACSF ile dolu buz gibi petri kabında, beyni bir filtre zarına yerleştirin. Hemisferleri ayırın ve 45 derecelik bir açıyla parasagittal kesim yapın. Vibratome doku aşamasında bir yarımküreyi süper yapıştırıcı ile düzeltin ve doku bloğunu hemen %5 karbondioksit ve %95 oksijen le kabardırılmış buz gibi ACSF içeren Vibratome banyosuna aktarın.
Vibratome banyosundaki dokuyu hizala. Dilimleme kadar buz gibi ACSF ikinci yarımkürede tutun. Vibratomu 250 ila 400 mikrometrelik dilimler kesecek şekilde ayarlayın.
Dilim kestikten sonra, tipik morfolojik görünüme göre hipokampal oluşumunu belirlemek ve hipodermik iğneler kullanarak izole, hipokampus bitişik serebral korteks parçası tutmak. Tüm dilimler toplanana kadar 34 santigrat dereceye ısıtılan ve %5 karbondioksit ve %95 oksijen ile kabarmış acsf bir örgü üzerine dilim yerleştirin. Dilimleri steril koşullarda devam etmek için laminar akış kabinine aktarın.
Ters, steril, cam pasteur pipetile, acsf'deki dilimleri steril Hanks'tuz çözeltisi ile doldurulmuş önceden ısıtılmış Petri kaplarından birine nazikçe aktarın. Pipetdeğiştirin ve dilimleri ikinci kültür yemeğine aktarın. İşlemi genel olarak beş kez tekrarlayın.
Mümkün olduğunca az HBSS'yi aşağıdaki kültür plakalarına aktarın. Pipet kullanarak, kültür kesici ucunun üstüne bir seferde bir dilimi nazikçe yerleştirin. Pipetteki türbülanslardan kaçının ve dilim Pasteur pipetinin ucuna inene kadar bekleyin.
Her dilim için işlemi tekrarlayın. Bir membran üzerine iki dilim yerleştirin. İnce bir ipucu kullanarak fazla Hank çözeltisini kesici ucun üstünden dikkatlice çıkarın.
Deney gününe kadar kültürleri %5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde tutun. Orta yı her 2-3 günde bir değiştirin. Dokuya dokunmadan seyreltilmiş vektörün 0,5 mikrolitresini doğrudan her dilimin üstüne uygulayın.
Son olarak, dilimleri kuvöze geri yerleştirin ve en az altı gün daha orada saklayın. Bir deneye başlamadan hemen önce, kültür lüzumlu dilimleri içeren bir kesici ucu steril kaputa aktarın ve bir mililitre lik organotipik dilim kültür ortamı veya en az gerekli ortamı içeren 30 milimetrelik bir tabağa yerleştirin. Tabağı stereoskopun altına yerleştirin ve dilimin yüzeyine odaklanın.
Seçilen dilimin dar kenarlarında ve üst tabakada altındaki dokuya zarar vermeden kısa bir çapraz kesim yapmak için iki steril hipodermik iğne kullanın. Uçtan hazırlanan dilimi çıkarmak için, cımbızla membranın kenarlarını tutun ve zara düz, paralel kesimler yapmak için steril bir neşter kullanın, ortada dilimle bir kare veya üçgen oluşturarak. Kesici uçek dilimler barındırıyorsa, orijinal plakaya ve kuluçka makinesine geri aktarın.
Ortamın yüzey gerilimi membran yüzeyine sızmasını önleyecektir. Deneysel ACSF hazırlayın ve en az otuz dakika boyunca karbogen kaynağına bağlı bir eklenmiş boru ile% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit ile köpüren 7,4 bir pH elde. Tüm deney boyunca tuzlu yu kabarcıklı tutun.
Sonra monokromatör floresan ışık kaynağı açın. Organotipik dilim kültürünü deneysel odaya aktarın. Çerçeve aşağı, kültür dokunmadan ve dikiş iplikleri yukarı, membran dokunmadan organotipik dilim kültürünün üstüne bir ızgara yerleştirin.
Odayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve perfüzyon sistemine bağlayın. Peristaltik pompayı dakikada 1,5 ila 2,5 mililitre akış hızında açın. Perfüzyon sisteminin sızdırmazlık olmadığından emin olun.
İletim ışığını kullanarak, kültürlü dilimi odak noktası haline getirin ve deneylerin yapılacağı alanı belirleyin. Görüntüleme denemelerine başlamadan önce, dilimlerin tuzlu koşullara uyum sağlaması için en az 15 dakika bekleyin, ardından kamerayı ve görüntüleme yazılımını açın. Donör floresan proteini 435 nanometrede heyecanlandırın.
Pozlama süresini 40 ila 90 milisaniye arasında ayarlayın. Sonra dikroik ayna ve filtreleri ışın ayırıcı ünitesine takın. Floresan emisyonuna emisyon farkını emisyon görüntü ayırıcısıyla 500 nanometreye bölün ve donör ve alıcı floresanını daha fazla izole etmek için 482 artı veya eksi 16 ve 542 artı veya eksi 13,5 nanometre bant geçiş filtreleri uygulayın.
Arka plan çıkarma için hücresel floresan yoksun görünen bir ilgi bölgesi seçin. RoI'lar oluşturmak için ekrandaki görüntüdeki etiketli dokunun tek yapılarını daire içine alın. Görüntü edinme sıklığını ve genel kayıt süresini ayarlayın.
30 dakikadan uzun deneylerde fototoksisiteyi önlemek için 0,2 ila 0,5 Hertz elde etme sıklığı önerilir. Daha sonra, kaydı başlatın. Hücre içi ATP'de değişiklikler emdirmek için perfüzyon tüpünü standart ACSF'den metabolik inhibitörler içeren bir tuzlu tüpe, örneğin kimyasal iskemi çözeltisine geçirin.
Alternatif olarak, aktif nöronlardan potasyum iyon salınımını taklit etmek için sekiz milimolar yüksek potasyum konsantrasyonu ile bir salin kullanın. Kayıtlardan hemen sonra, deneysel ACSF'yi yığınlarla arabelleğe alan ACSF ile değiştirin. Daha sonra dilim kültürünü içeren kayıt odasını konfokal lazer taramalar mikroskobuna aktarın.
Verilen optik yapılandırmada mümkün olan en yüksek Z çözünürlüğünde Z yığını görüntülerini alın. Bu protokolde, transdüksiyondan on gün sonra, ATeam 1.03 YEMK'yi ifade eden nöronlar, dilim yüzeyinin 50 mikrometre altında, kültürlü doku dilimlerinin neokorteksinde yüksek yoğunlukta bulunmuştur. Hipokampusta karşılaştırılabilir sonuçlar elde edildi.
Astrositler için, ATeam 1.03 YEMK insan glial fibrolary asidik protein organizatörü kontrolü altında ifade edildi, ve hipokampal nöronlar ATeam ifade organotipik dilimler 1.03 YEMK seçilen ROI piramidal hücrelerin somata temsil. Bir dakika boyunca ekstrasellüler glikoz yokluğunda 5 milimolar sodyum azit etüt sonra, ters değişiklikler FRET çiftinin emisyon yoğunluğu nda indüklenen edildi. ATeam FRET oranında da geri dönüşümlü bir düşüş gözlendi.
Nöronlar ve astrositlerde temel koşullar altında 14 farklı hücrede uzun süreli ATeam FRET oranı ATeam'in güvenilir ve kararlı bir sensör olduğunu göstermektedir. Kimyasal iskemi, bu deneyin sonunda her iki hücre tipinde de ATeam oranında beklenen güçlü düşüşe neden olduğunu lütfen unutmayın. Hücre dışı potasyum konsantrasyonundaki üç ila sekiz dakika arasında bir artış ATeam 1.03 YEMK ifade nöronlarda tespit edilebilir bir değişiklik neden olmadı.
Buna karşılık, astrositler ATeam FRET oranında geri dönüşümlü bir artış ile ekstrasellüler potasyum artışına tepki, hücre içi ATP düzeylerinde bir artış gösteren. Yine, kimyasal iskemi ATeam oranında hemen bir azalmaya neden, sensör ATP değişiklikleri algılayabilir gösteren. Burada açıklandığı gibi FRET tabanlı hücresel görüntüleme çalışırken, organotipik kültürlerde yüksek kaliteli dilim üretimi önemli bir adım olduğunu akılda tutmak önemlidir.
Ayrıca glial yaranın dikkatli bir şekilde çıkarılması ve uzman düzeyinde görüntüleme gerekmektedir. Bu prosedürü takiben, bir de hücresel metabolitleri için farklı diğer FRET tabanlı nanosensor içeren deney yapmak gerekir. Örneğin, glikoz veya laktat için olanlar.
Son olarak, hayvanların korunması için ilgili eylemlerin her zaman gözönünde ruyulması gerektiği vurgulanmalıdır. Bu aynı zamanda genetiği değiştirilmiş organizmaların işlenmesiyöneten etkili yasalar için de geçerlidir.
