여기서는 ATP에 민감한 FRET 센서 ATeam 1.03 YEMK를 사용하여 유기성 배양 마우스 해마 슬라이스에서 신경 및 성상세포 ATP 수준의 변화를 역동적으로 측정하는 방법을 시연합니다. 이 기술의 주요 장점은 제어 된 환경에서 살아있는 뇌 조직에서 에너지 대사를 연구 할 수 있다는 것입니다, 높은 센서 발현 수준을 가진 환경. 이 기술은 병원체 기계장치, 근본적인 질병, 또는 두뇌 손상, 예를 들면, 허혈성 치기 같이 에너지 박탈에 기인한 두뇌 손상에 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
그것은 수 있습니다., 원칙적으로, ATP 수준을 공부 하는 데 사용할 수 있습니다., 뿐만 아니라 뇌 조직에서, 하지만 다른 장기에서 뿐만 아니라. 이 실험을 성공적으로 실행하려면 조직을 매우 신중하게 배양하고 불임을 유지하는 데 관련된 모든 단계를 수행하는 것이 필수적입니다. 더욱이, 세포 형광 화상 진찰의 몇몇 지식이 필요합니다.
가장 정교한 접근 방식과 시각화의 조직 처리는 적절한 절차를 이해하는 데 필수적입니다. 이미징 실험도 마찬가지입니다. 절차를 시연하는 것은 포스트독인 로드리고 르춘디와 실험실의 석사 학생인 나 황이 될 것입니다.
ACSF로 채워진 얼음 차가운 페트리 접시에 뇌를 필터 멤브레인에 놓습니다. 반구를 분리하고 45도 각도로 기생 절단을 수행합니다. 진동 조직 단계에서 한 반구를 슈퍼 접착제로 수정하고, 즉시 5 %의 이산화탄소와 95 %의 산소로 버블 얼음 차가운 ACSF를 포함하는 진동 욕조로 조직 블록을 전송합니다.
진동 욕조의 조직을 정렬합니다. 슬라이스 할 때까지 얼음 차가운 ACSF에 두 번째 반구를 유지합니다. 진동을 조정하여 250~400마이크로미터의 슬라이스를 잘라냅니다.
슬라이스를 절단 한 후, 전형적인 형태학적 외관에 따라 해마 형성을 식별하고 피하 바늘을 사용하여 분리하여 해마에 인접한 대뇌 피질의 일부를 유지합니다. ACSF의 메쉬에 슬라이스를 놓고 섭씨 34도까지 데워지고 모든 조각이 수집될 때까지 이산화탄소 5%와 산소로 거품을 낸다. 슬라이스를 라미나르 플로우 캐비닛으로 이송하여 멸균 조건에서 계속합니다.
반전된 멸균 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하면 ACSF의 슬라이스를 멸균 행크스 의 소금 용액으로 채워진 미리 따뜻하게 데운 페트리 요리 중 하나로 부드럽게 전달합니다. 파이펫을 변경하고 두 번째 문화 접시에 조각을 전송합니다. 전체적으로 프로세스를 다섯 번 반복합니다.
가능한 한 적은 HBSS를 다음 문화 판으로 옮길 수 있습니다. 파이펫을 사용하여 배양 인서트의 상단에 한 번에 한 조각을 부드럽게 놓습니다. 파이펫의 난기류를 피하고 슬라이스가 파스퇴르 파이펫 끝으로 내려갈 때까지 기다립니다.
각 슬라이스에 대한 프로세스를 반복합니다. 멤브레인에 두 조각을 놓습니다. 미세 팁을 사용하여 삽입 상단에서 초과 행크 용액을 조심스럽게 제거합니다.
가습된 인큐베이터에 배양을 5%의 이산화탄소와 섭씨 37도로 유지하여 실험 당일까지 보관하십시오. 매 2 ~3 일마다 매체를 교체하십시오. 조직을 건드리지 않고 희석된 벡터의 0.5 마이크로리터를 각 슬라이스의 맨 위에 직접 적용하십시오.
마지막으로, 조각을 인큐베이터에 다시 넣고 적어도 6 일 동안 보관하십시오. 실험을 시작하기 직전에 배양 된 조각을 포함하는 삽입을 멸균 후드에 옮기고 organotypic 슬라이스 배양 배지 1 밀리리터 또는 최소한의 필수 매체를 포함하는 30mm 접시에 넣습니다. 접시를 스테레오스코프 아래에 놓고 슬라이스 표면에 초점을 맞춥니다.
두 개의 멸균 피하 주사바늘을 사용하여 선택한 슬라이스의 좁은 가장자리와 아래 조직을 손상시키지 않고 상부 층에서 짧은 교차 컷을 만듭니다. 인서트에서 준비된 슬라이스를 제거하려면 멤브레인의 가장자리를 핀셋으로 잡고 멸균 메스를 사용하여 멤브레인에 직선적이고 병렬로 절단하여 중앙에 슬라이스가 있는 사각형 또는 삼각형을 형성합니다. 인서트가 추가 조각을 호스팅하는 경우 원래 플레이트로 다시 전송하고 인큐베이터로 옮김합니다.
매체의 표면 장력은 멤브레인의 표면에 누출되는 것을 방지합니다. 실험 ACSF를 준비하고 적어도 30분 동안 카보겐 공급에 연결된 삽입된 튜브를 통해 95%의 산소와 5%의 이산화탄소로 버블링하여 7.4의 pH를 얻을 수 있다. 전체 실험 중에 식염수 거품을 유지합니다.
그런 다음 흑백의 형광원을 켭뜨꿉을 켭뜨꿉타. 조직형 슬라이스 문화를 실험 챔버로 옮킨다. 배양에 닿지 않고 프레임 아래로 오르가노티픽 슬라이스 배양 위에 격자를 놓고, 실을 위로 올려 멤브레인에 닿습니다.
현미경 단계에 챔버를 놓고 관류 시스템에 연결합니다. 분당 1.5~2.5밀리리터의 유량으로 연동 펌프를 켭타보합니다. 관류 시스템의 누출이 없는지 확인하십시오.
전송 광을 사용하여 배양 된 조각을 초점으로 가져 와서 실험이 수행되어야하는 영역을 식별하십시오. 이미징 실험을 시작하기 전에 적어도 15분 동안 기다렸다가 슬라이스가 식염수 조건에 적응한 다음 카메라와 이미징 소프트웨어를 전환할 수 있습니다. 435 나노미터에서 기증자 형광 단백질을 흥분시킵니다.
노출 시간을 40~90밀리초 로 설정합니다. 그런 다음 이색 거울과 필터를 빔 스플리터 장치에 삽입합니다. 방출 영상 스플리터로 500 나노미터에서 형광 방출을 분할하고, 482 플러스 또는 마이너스 16 및 542 플러스 또는 마이너스 13.5 나노미터에서 밴드 패스 필터를 사용하여 기증자와 수용자 형광을 더욱 격리시합니다.
배경 감산에 대한 셀룰러 형광이 없는 관심 영역을 선택합니다. 화면에 표시된 조직의 단일 구조를 원로하여 ROI를 만듭니다. 이미지 수집 빈도및 전체 녹화 시간을 설정합니다.
30분 이상 실험을 할 경우, 광독성을 방지하기 위해 0.2~0.5Hertz의 획득 빈도를 권장합니다. 그런 다음 레코딩을 시작합니다. 세포 내 ATP의 변화를 유도하기 위해, 관혈관을 표준 ACSF에서 대사 억제제가 함유된 식염수로 전환합니다( 예: 화학허혈 용액).
또는, 활성 뉴런에서 칼륨 이온의 방출을 모방 하는 8 밀리 머에서 높은 칼륨 농도와 식염수를 사용 하 여. 레코딩 직후, 실험 ACSF를 힙 버퍼링 ACSF로 교환합니다. 그런 다음 슬라이스 배양을 포함하는 기록 챔버를 공초점 레이저 스캔 현미경으로 이송한다.
주어진 광학 구성에서 가능한 가장 높은 Z 해상도로 Z 스택 이미지를 가져옵니다. 이 프로토콜에서, 10일 후에, ATeam 1.03 YEMK를 표현하는 뉴런은 슬라이스 표면 아래 최대 50 마이크로미터의 깊이에서 배양된 조직 조각의 신혈구에서 고밀도에서 발견되었다. 유사한 결과는 해마에서 달성되었습니다.
성상세포의 경우, ATeam 1.03 YEMK는 인간 신경교 섬유라리 산성 단백질 프로모터의 통제하에 발현되었으며, 선택된 ROI는 피라미드 세포의 소마타를 나타내는 해마 뉴런에서 ATeam 1.03 YEMK를 발현하는 조직화 슬라이스를 발현하였다. 1분 동안 세포외 포도당이 없는 상태에서 5 밀리몰라 나트륨 아지드에 슬라이스를 노출한 후, FRET 쌍의 방출 강도에서 반대의 변화가 유도되었다. ATeam FRET 비율의 가역적 감소도 관찰되었다.
뉴런과 성상세포의 기준조건 하에서 14개의 다른 세포에서 장기 ATeam FRET 비율은 ATeam이 안정적이고 안정적인 센서임을 보여줍니다. 화학적 허혈은 이 실험이 끝날 때 두 세포 유형모두에서 ATeam 비율이 강해집니다. 세포외 칼륨 농도가 3~8밀리미터에서 3분 으로 증가하여 ATeam 1.03 YEMK를 발현하는 뉴런의 검출 가능한 변화를 초래하지 못했다.
대조적으로, 성상 세포 칼륨의 증가에 반응 ATeam FRET 비율의 가역적 인 증가에 의해, 세포 내 ATP 수준의 증가를 나타내는. 다시 말하지만, 화학 적 허혈은 ATeam 비율이 즉각적인 감소를 일으켜 센서가 ATP의 변화를 감지 할 수 있음을 보여줍니다. 여기에 설명된 바와 같이 FRET 기반 세포 이미징을 시도할 때, organotypic 문화권에서 고품질 슬라이스의 생산이 중요한 단계라는 것을 명심하는 것이 중요합니다.
또한, 신경교 흉터와 전문가 수준의 이미징을 주의 깊게 제거해야합니다. 이 절차에 따라, 하나는 또한 세포 대사 산물에 대 한 다른 다른 FRET 기반 나노 센서를 통합 하는 실험을 수행 할 수 있어야. 예를 들면, 포도당 또는 젖산을 위한 그.
마지막으로, 동물 보호를 위한 관련 행위를 항상 준수해야 한다는 점을 강조해야 합니다. 이것은 또한 유전자 변형 된 유기체의 처리를 지배하는 효과적인 법률에 대한 사실이다.
