Aqui demonstramos como empregar o sensor FRET sensível ao ATP ATeam 1.03 YEMK para medições dinâmicas de mudanças nos níveis de ATP neuronal e astrócito em fatias hipocampais de camundongos organotipicamente cultivadas. A principal vantagem dessa técnica é que se pode estudar o metabolismo energético no tecido cerebral vivo em um ambiente controlado, um ambiente com altos níveis de expressão de sensores. Essa técnica pode ajudar a obter insights sobre os mecanismos de trajetória, doenças subjacentes ou danos cerebrais, por exemplo, causados pela privação de energia, como o derrame isquêmico.
Pode, em princípio, ser usado para estudar níveis de ATP, não apenas no tecido cerebral, mas em outros órgãos também. Para executar este experimento com sucesso, é essencial realizar todas as etapas envolvidas na cultura do tecido extremamente cuidadosa e manter a esterilidade. Além disso, é necessário algum conhecimento sobre imagens fluorescentes celulares.
O manuseio de tecidos na abordagem mais sofisticada e uma visualização são vitais para entender os procedimentos adequados. O mesmo vale para experimentos de imagem. Demonstrando o procedimento estarão Rodrigo Lerchundi, pós-doutor, e Na Huang, um estudante de mestrado do laboratório.
Em uma placa de Petri gelada cheia de ACSF, coloque o cérebro em uma membrana de filtro. Separe os hemisférios e realize um corte parasagittal em um ângulo de 45 graus. Fixar um hemisfério no estágio do tecido Vibratome com supercola, e transferir imediatamente o bloco de tecido para o banho vibratome contendo ACSF gelado borbulhado com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio.
Alinhe o tecido no banho vibratome. Mantenha o segundo hemisfério em ACSF gelado até cortar. Ajuste o Vibratome para cortar fatias em 250 a 400 micrômetros.
Após cortar a fatia, identifique a formação hipocampal com base em sua aparência morfológica típica e isole-a usando agulhas hipodérmicas, mantendo a parte do córtex cerebral adjacente ao hipocampo. Coloque a fatia em uma malha em ACSF, aquecida a 34 graus Celsius e borbulhada com 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio até que todas as fatias sejam coletadas. Transfira as fatias para o armário de fluxo laminar para continuar em condições estéreis.
Com uma pipeta pasteur invertida, estéril e de vidro, transfira suavemente as fatias do ACSF para uma das placas de Petri pré-aquecidas cheias de solução de sal estéril hanks. Troque a pipeta e transfira as fatias para o segundo prato de cultura. Repita o processo cinco vezes no total.
Transfira o mínimo de HBSS possível para as seguintes placas de cultura. Usando uma pipeta, coloque delicadamente uma fatia de cada vez no topo da inserção da cultura. Evite turbulências na pipeta e espere até que a fatia desça até a ponta da pipeta Pasteur.
Repita o processo para cada fatia. Coloque duas fatias em uma membrana. Remova cuidadosamente qualquer solução Hank em excesso da parte superior da inserção usando uma ponta fina.
Mantenha as culturas em uma incubadora umidificada a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius até o dia do experimento. Substitua o meio a cada dois ou três dias. Sem tocar no tecido, aplique 0,5 microliters do vetor diluído diretamente na parte superior de cada fatia.
Por fim, coloque as fatias de volta na incubadora e mantenha-as lá por pelo menos mais seis dias. Pouco antes de iniciar um experimento, transfira uma inserção contendo fatias cultivadas no capô estéril, e coloque-a em um prato de 30 milímetros contendo um mililitro de cultura de fatia organotípica, ou meio essencial mínimo. Coloque o prato sob o estereoscópio e concentre-se na superfície da fatia.
Use duas agulhas hipodérmicas estéreis para fazer um corte cruzado curto nas bordas estreitas de uma fatia escolhida, e na camada superior sem danificar o tecido por baixo. Para remover a fatia preparada da inserção, segure as bordas da membrana com pinças e use um bisturi estéril para fazer cortes retos e paralelos à membrana, formando um quadrado ou um triângulo com a fatia no centro. Se a inserção hospedar fatias adicionais, transfira-a de volta para a placa original e para a incubadora.
A tensão superficial do meio evitará seu vazamento na superfície da membrana. Prepare acsf experimental e obtenha um pH de 7,4 borbulhando-o com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono através de uma tubulação inserida conectada ao suprimento de carbogênio por pelo menos trinta minutos. Mantenha o soro fisiológico borbulhado durante todo o experimento.
Em seguida, ligue a fonte de luz fluorescente do monocrometro. Transfira a cultura organotipípica para a câmara experimental. Coloque uma grade em cima da cultura de fatia organotípica com o quadro para baixo, não tocando a cultura, e os fios para cima, tocando a membrana.
Coloque a câmara no estágio do microscópio e conecte-a ao sistema de perfusão. Ligue a bomba peristáltica a uma vazão de 1,5 a 2,5 mililitros por minuto. Certifique-se de que não há vazamento do sistema de perfusão.
Utilizando a luz de transmissão, enfoque a fatia cultivada e identifique a área onde os experimentos devem ser realizados. Antes de iniciar experimentos de imagem, espere pelo menos 15 minutos para permitir que as fatias se adaptem às condições salinas e liguem a câmera e o software de imagem. Excite a proteína fluorescente doadora a 435 nanômetros.
Ajuste o tempo de exposição entre 40 a 90 milissegundos. Em seguida, insira o espelho dicroico e os filtros na unidade divisora de feixe. Divida a emissão de fluorescência em 500 nanômetros com um divisor de imagem de emissão, e empregue filtros de passe de banda em 482 mais ou menos 16 e 542 mais ou menos 13,5 nanômetros para isolar ainda mais a fluorescência de doadores e aceitadores.
Selecione uma região de interesse aparentemente desprovida de fluorescência celular para subtração de fundo. Circule estruturas únicas de tecido rotulado na imagem na tela para criar ROIs. Defina a frequência de aquisição de imagens e o tempo total de gravação.
Para experimentos com mais de 30 minutos, recomenda-se uma frequência de aquisição de 0,2 a 0,5 Hertz para prevenir a fototoxicidade. Posteriormente, inicie a gravação. Para induzir alterações no ATP intracelular, troque o tubo de perfusão do ACSF padrão para um soro fisiológico contendo inibidores metabólicos, por exemplo, solução de isquemia química.
Alternativamente, use um soro fisiológico com concentração elevada de potássio a oito milimólares para imitar a liberação de íons de potássio de neurônios ativos. Logo após as gravações, troque o ACSF experimental com o ACSF tamponado por montes. Em seguida, transfira a câmara de gravação contendo a cultura da fatia para o microscópio de varredura a laser confocal.
Tire imagens de pilha Z na resolução Z mais alta possível na configuração óptica dada. Neste protocolo, dez dias após uma transdução, neurônios expressando ATeam 1.03 YEMK foram encontrados em alta densidade no neocórtex de fatias de tecidocultural em profundidades de até 50 micrômetros abaixo da superfície da fatia. Resultados comparáveis foram alcançados no hipocampo.
Para os astrócitos, o ATeam 1.03 YEMK foi expresso sob o controle do promotor de proteínas ácidas gliais gliais humanos, e as fatias organotípicas expressando ATeam 1.03 YEMK nos neurônios hipocampais selecionados rois representam a somata das células piramiais. Depois de expor a fatia a 5 milimônios de sódio na ausência de glicose extracelular por um minuto, alterações opostas foram induzidas na intensidade de emissão do par FRET. Também foi observada uma diminuição reversível na relação ATeam FRET.
A relação ATeam FRET de longo prazo em 14 células diferentes sob condições básicas em neurônios e astrócitos mostram que o ATeam é um sensor confiável e estável. Observe que a isquemia química resultou na queda forte esperada na relação ATeam em ambos os tipos de células no final deste experimento. Um aumento na concentração extracelular de potássio de três para oito milimólares por três minutos não resultou em uma alteração detectável nos neurônios expressando ATeam 1.03 YEMK.
Em contraste, os astrócitos reagiram ao aumento do potássio extracelular por um aumento reversível na relação ATeam FRET, indicando um aumento nos níveis de ATP intracelulares. Mais uma vez, a isquemia química causou uma redução imediata na relação ATeam, demonstrando que o sensor pode detectar alterações no ATP. Ao tentar imagens celulares baseadas em FRET como descrito aqui, é importante ter em mente que a produção de fatias de alta qualidade em culturas organotipas é um passo fundamental.
Além disso, é necessária uma remoção cuidadosa da cicatriz gliais e da imagem de nível especializado. Após este procedimento, deve-se também ser capaz de realizar experimentos incorporando diferentes outros nanosensor baseados em FRET para metabólitos celulares. Por exemplo, aqueles para glicose ou lactato.
Por último, mas não menos importante, é preciso ressaltar que devem ser sempre observados atos relevantes para a proteção dos animais. Isso também é verdade para as leis eficazes que regem o manuseio de organismos geneticamente modificados.
