Questo metodo di co-coltura transwell viene utilizzato per studiare la segnalazione paracrina utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Questo metodo può essere usato per scoprire nuovi ligandi secreti, così come le basi meccaniche dei loro effetti soppressivi immunitari. In precedenza abbiamo usato questo metodo per mostrare come i fattori secreti dal tumore possono smorzare la trascrizione genica pro-infiammatoria del macrofago.
Crediamo che questo strumento abbia implicazioni ad ampio raggio nello studio della soppressione immunitaria derivata dal tumore. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che può essere utilizzata per studiare la segnalazione paracrina tra cellule tumorali e cellule immunitarie senza la variabile potenzialmente confusa del contatto da cellula a cellula. Questa piattaforma è anche suscettibile a una varietà di tecniche biologiche molecolari per l'analisi a valle.
Dopo aver raccolto i macrofagi peritoneali, placcarli direttamente nelle camere superiori di una membrana in poliestere da 0,4 micrometri inserire co-coltura piastra a sei poggiagli. Quindi aggiunto DMEM integrato al pozzo in modo che la camera superiore contenga un millilitro e la camera inferiore contenga 1,5 millilitri. Incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
In primo luogo, la coltura disponibile in commercio cellule tumorali nel rispettivo mezzo, seguendo i metodi di coltura tissutale raccomandati dall'ATCC. Quindi, lavare le cellule tumorali aderenti una volta con PBS. Aggiungere lo 0,05% di tripside in EDTA e incubare a 37 gradi Celsius fino a quando le cellule non si staccano.
Quindi sospendere di nuovo le celle nei supporti contenenti FBS. Utilizzare un emocitometro o un contatore cellulare per quantificare il numero totale di cellule e centrifugare a 220 volte G per cinque minuti a pellet. Durante la centrifugazione, aspirare il mezzo dalle camere superiore e inferiore del macrofago contenente piastre di supporto a membrana permeabili e sostituirlo con mezzo fresco.
Per le camere inferiori in cui verranno placcate le cellule tumorali, riempire con un millilitro di mezzo invece di 1,5 millilitri per lasciare un volume sufficiente per l'addizione cellulare. Una volta completata la centrifugazione, aspirare il mezzo dalle cellule tumorali pellettate e sospendere nuovamente le cellule in DMEM integrato ad una concentrazione di 300.000 cellule per millilitro. Aggiungere 0,5 millilitri di questa sospensione cellulare alla camera inferiore dei possedimenti desiderati.
Per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria del macrofago, trattare macrofagi singolarmente o co-coltivati aggiungendo gamma di interferone ad una concentrazione di 100 nanogrammi per millilitro e LPS ad una concentrazione di 50 nanogrammi per millilitro. Variare la durata dei tempi di trattamento in coltura in base alle esigenze. L'attivazione del macrofago avviene entro due ore e alcune soppressione mediate dal tumore si verificano di otto ore.
La co-coltura per 24 ore produce una soppressione robusta e costante derivata dal tumore. Come controllo negativo, la cultura macrofagi singolarmente e non trattata. Come controllo positivo, trattare macrofagi coltivati singolarmente con gamma di interferone e LPS alle stesse concentrazioni utilizzate per i campioni.
Trascorso il tempo di incubazione desiderato, isolare il lisato cellulare o condizionare il mezzo di coltura come desiderato a seconda delle esigenze di test. Per isolare il lisato cellulare per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi, aspirare il mezzo da entrambe le camere del pozzo e lavare una volta con due millilitri di PBS. Applicare il buffer di lisi dell'RNA sulla camera superiore contenente i macrofagi.
Successivamente, raschiare delicatamente la membrana per rilasciare il llysate cellulare e trasferirlo in un tubo di raccolta per un'ulteriore lavorazione secondo il protocollo del produttore del kit di isolamento dell'RNA. Il metodo di co-coltura qui descritto coinvolge la coltura di macrofagi e cellule tumorali senza contatto fisico. I macrofagi peritoneali coltivati in assenza di cellule tumorali sono usati come controlli negativi e positivi.
I macrofagi peritoneali co-coltivati in presenza di cellule tumorali B16F10 ma senza attivare stimoli non aumentano l'espressione dei geni associati pro-infiammatori. Ciò implica che i ligandi secreti dal tumore non sono sufficienti per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria da soli, o se c'è l'attivazione immunitaria da secrezioni tumorali, i ligandi paracrini sono sufficienti a sopprimerlo ai suoi livelli nativi. Questo metodo di co-coltura illustra che quando i macrofagi polarizzati da gamma di interferone e LPS sono coltivati in presenza di cellule tumorali, la soppressione dell'espressione genica associata all'infiammazione è stata ridotta fino al 60%Un livello comparabile di soppressione genica pro-infiammatoria del macrofago si osserva quando la linea cellulare del macrofago murino J774 viene sostituita dai macrofagi peritoneali.
Il lavoro precedente ha identificato la proteina S come un fattore secreto dal tumore che può inibire l'attivazione del macrofago, quindi il modello di co-coltura di supporto della membrana permeabile viene utilizzato in combinazione con una lysA per saggiare la concentrazione di proteina S nei mezzi condizionati dopo 24 ore. Nei mezzi condizionati da cellule di melanoma B16F10 trattate con LPS, la proteina S è espressa in una concentrazione di circa 475 nanogrammi per millilitro. I macrofagi peritoneali trattati nelle stesse condizioni hanno espresso proteine S a circa 61 nanogrammi per millilitro.
È interessante notare che, quando co-coltivata, la concentrazione della proteina S nella gamma dell'interferone e nel pozzo trattato con LPS era di circa 86 nanogrammi per millilitro. Ciò suggerisce che o i macrofagi ingeriscono la proteina S secreta dal tumore o che la quantità di proteina S secreta dalle cellule B16F10 è sostanzialmente diminuita quando in presenza di macrofagi. Questi risultati evidenziano profondi cambiamenti nell'attivazione dei macrofagi e nella segnalazione paracrina quando i macrofagi sono co-coltivati con cellule tumorali.
Il metodo di cocultura di Transwell può rispondere a una varietà di domande relative alla segnalazione paracrina. L'analisi western delle macchie potrebbe essere condotta per determinare come le proteine secrete dal tumore alterino varie vie di segnalazione nei macrofagi.
