Qui presentiamo un solido protocollo per il rilevamento di batteri all'interno del tessuto vescicale biopsied, che ha ampie applicazioni a molti tipi di tessuti in cui si sospetta che i batteri siano presenti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è imparziale. Permette al ricercatore di rilevare batteri all'interno dei tessuti senza conoscere a priori quali specie batteriche sono presenti.
Questa tecnica può aiutare a determinare se i batteri hanno invaso le pareti vescicali delle donne con infezione ricorrente del tratto urinario e informare le scelte terapeutiche come la selezione di antibiotici penetranti nei tessuti. Sebbene progettata per i tessuti vescicale, questa tecnica può essere ampiamente applicata ad altri tessuti con popolazioni batteriche residenti con un'ottimizzazione minima. Gli individui che sono nuovi a questa tecnica possono avere difficoltà con il posizionamento delle copertine e l'imaging.
Concentrati sull'ottimizzazione del posizionamento delle copertine per ridurre le bolle e praticare l'imaging su campioni non preziosi. Ad aiutare a dimostrare questa procedura sarà Jashkaran Gadhvi, uno studente laureato nel mio laboratorio. Per iniziare questa procedura, pulire una cappa aspirante vuota o un armadio di biosicurezza opportunamente montato con il 70% di etanolo.
Preparare tutti i buffer e i reagenti necessari come indicato nel protocollo di testo. Quindi, pulire cinque barattoli di Coplin con 70% di etanolo e lasciare asciugare i barattoli. Quando i barattoli sono asciutti, etichettarli come mostrato qui e riempirli con 100 millilitri della soluzione appropriata.
Nella cappa dei fumi, posizionare due diapositive per biopsia in un porta scorrevole verticale. Posizionare il porta scorrevole verticale nel barattolo Xylenes 1 Coplin per 10 minuti. Successivamente, rimuovere il portapacchi dal barattolo e asciugare il fondo su un tovagliolo di carta per rimuovere gli xileni in eccesso.
Posizionare il rack nel barattolo Xylenes 2 per 10 minuti. E poi reidratare le sezioni di tessuto de-paraffinato in lavaggi di etanolo successivi per 10 minuti ciascuno. Una volta completati i lavaggi, asciugare la parte inferiore del portapacchi sugli asciugamani di carta per rimuovere l'etanolo in eccesso e posizionare il rack nel barattolo Coplin contenente 100 millilitri di filtro sterilizzato, acqua distillata doppia per 10 minuti.
Durante questo lavaggio, diluire le sonde a 10 nanomolari nel tampone di ibridazione per creare la soluzione di colorazione, assicurandosi di preparare 150 microlitri di soluzione di colorazione per diapositiva. Preparare una camera umidificante per ogni sonda aggiungendo una salvietta delicata imbevuta e accartocciata e acqua sterile a un serbatoio di una scatola di punta P1000. Posizionare la cartuccia porta punta sopra in quanto è qui che si siederanno le diapositive.
Al termine del lavaggio finale, rimuovere lo scivolo dal porta scorrevole e posizionarlo su un tovagliolo di carta fresco, lato tessuto verso l'alto. Utilizzare una delicata salvietta per asciugare lo scivolo, facendo attenzione solo delicatamente tamponare vicino ma non sulla sezione della biopsia per assorbirla. Utilizzando una penna idrofobica, disegnare un bordo intorno alla sezione della biopsia e posizionare il lato del tessuto di scorrimento nella camera umidificante.
Quindi, posizionare la camera umidificante in un'incubatrice impostata su 50 gradi Celsius. Pipetta tra 50 e 150 microlitri della soluzione di colorazione direttamente sopra il tessuto in modo che il rettangolo realizzato dal bordo idrofobico intorno al tessuto sia riempito e chiudere delicatamente la scatola. Incubare durante la notte a 50 gradi Celsius al buio.
Se l'incubatore ha una finestra, coprirla con un foglio di alluminio per creare un ambiente buio. La mattina seguente, rimuovere le diapositive dalle camere umidificanti e rimuovere rapidamente qualsiasi soluzione di ibridazione rimanente con una delicata salvietta per compiti. Quindi posizionare i lati in un rack di colorazione verticale.
Posizionare il rack di colorazione in un barattolo coplin avvolto in alluminio contenente 100 millilitri del tampone di lavaggio prerischiato per 10 minuti. Ripeti questo passaggio di lavaggio altre due volte con tampone di lavaggio fresco in nuovi barattoli Coplin. Durante queste fasi di lavaggio, preparare la contro-macchia diluire una soluzione stock di Hoechst 33342 in tampone di lavaggio, con un rapporto da uno a 1000.
Allo stesso tubo, aggiungere l'agglutinina germinale di grano Alexa-555 ad una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro e Alexa-555 Phalloidin ad una concentrazione finale di 33 nanomolare. Conservare al buio fino a quando non è pronto per l'uso. Al termine del lavaggio finale, rimuovere le diapositive dal barattolo Coplin e rimuovere delicatamente qualsiasi tampone di lavaggio in eccesso con una delicata salvietta per compiti.
Posizionare il lato tissutale delle diapositive su un tovagliolo di carta e aggiungere tra 50 e 150 microlitri di contromacchina direttamente sopra il tessuto in modo che il bordo idrofobico sia riempito, ma non traboccante. Coprire fino a quattro diapositive con un criobox-top e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Successivamente, riposizionare le diapositive nel rack di colorazione e lavarle altre due volte in barattoli Coplin contenenti tampone di lavaggio fresco, con ogni lavaggio della durata di 10 minuti.
Quindi asciugare accuratamente gli scivoli e posizionarli sul lato tissutale su un tovagliolo di carta sotto una criobox-top. Spremere una goccia di supporti di montaggio direttamente sopra il tessuto e posizionare delicatamente un coverslip di dimensioni appropriato sulla parte superiore. Premere delicatamente eventuali bolle e lasciare che le diapositive di coverslip si curino durante la notte al buio.
Il giorno successivo, sigillare i bordi delle copertine allo scivolo con una leggera mano di smalto chiaro e lasciare asciugare al buio per 10 minuti, prima di conservarli al buio a quattro gradi Celsius. Quando sei pronto per l'immagine delle biopsie macchiate, accendi il microscopio confocale e il software associato al microscopio. Inizia con una diapositiva positiva FISH e passa alla modalità di visualizzazione del computer.
Selezionare i canali per 405, 488 e 555. Impostare il foro stenopeica utilizzando il canale di lunghezza d'onda più lungo, che in questo caso è 555. Quindi trova l'attuale piano focale per la visualizzazione dei batteri etichettati nel canale 488.
Senza modificare il piano focale, impostare il guadagno, la potenza laser e l'offset per ogni canale in modo che il segnale non sia saturo e lo sfondo non sia sovra-corretto. Acquisisci l'immagine in tutti e tre i canali. In questo studio, i batteri associati ai tessuti vengono rilevati nelle biopsie della vescica umana da 16S rRNA FISH.
Questo protocollo è stato ottimizzato per il rilevamento imparziale di batteri associati alla mucosa vescica nelle sezioni di biopsia della vescica incorporate nella paraffina. Qui sono mostrate le micrografie confocali rappresentative di un esperimento che utilizza questo protocollo su sezioni di biopsie vescicali ottenute da donne con infezioni ricorrenti del tratto urinario. Due sezioni seriali sono ibridate con l'rRNA universale 16S o le sonde scramble.
Le immagini prese dalla stessa regione del tessuto e dei batteri sono chiaramente visibili nel tessuto ibridato con le sonde 16S rRNA, ma non sono con la sonda scramble. Sono possibili anche risultati falsi positivi. In questo rappresentante falso positivo, un segnale corrispondente al collagene autofluorescente o all'elastina viene rilevato nei canali 405 e 488 sia nelle sezioni di biopsia ibridata a rRNA 16S che scramble probe, evidenziando l'importanza di utilizzare sempre un controllo della sonda scramble.
Per prevenire lo sbiancamento fotografico, ridurre al minimo l'esposizione dei tessuti alla luce dopo l'applicazione delle sonde. Mentre questa tecnica consente il rilevamento imparziale di batteri nei tessuti umani, non fornisce informazioni specifiche alla specie. Multiplex-FISH con sonde specifiche della tassonomia potrebbe essere usato per identificare il genere o le specie presenti.
Prima dello sviluppo di questa tecnica, non era stato precedentemente dimostrato che i batteri potessero invadere la parete della vescica dei pazienti affetti da UTI ricorrenti nell'uomo. Ora stiamo usando sonde specifiche per genere e specie per determinare quali specie batteriche sono presenti. Gli xileni devono essere utilizzati in una cappa aspirante a causa della loro tossicità.
Si deve fare attenzione a non guardare direttamente nel laser durante l'imaging. Il laser deve essere spento durante il posizionamento dello scivolo sotto l'obiettivo.
