Questo protocollo può aiutare a rispondere a domande chiave sull'eterogeneità e le proprietà funzionali delle cellule epiteliali amniotiche umane isolate dalla membrana amniotica. Mentre i protocolli precedenti isolavano le cellule dalla membrana co-amniotica senza discernere tra le regioni, il nostro protocollo consente la coltura della popolazione cellulare isolata da tre distinte regioni anatomiche. Per separare la membrana amniotica per regione, in un armadio di biosicurezza in condizioni sterili, identificare l'amnio ombelicale che avvolge il cordone ombelicale, l'amnio placentare che copre la decidua basalis e la regione riflessa, che è considerata il resto dell'amnione che non è attaccato alla placenta.
Per sezionare la regione di amnione ombelicale, utilizzare le forcep di sezionamento per trattenere la porzione della membrana amnonica che copre la giunzione della placenta e del cordone ombelicale e utilizzare un bisturi per sezionare la regione che circonda il cordone, mentre si allunga per separare la regione dal corione. Quindi, depositare il tessuto separato in un becher etichettato con 100 millilitri di soluzione salina. Per sezionare la regione di amnozione placentare, utilizzare una garza di cotone sterile per rimuovere i coaguli di sangue dalla superficie del corione / amnione che copre la placenta.
E utilizzare le forcep di sezionazione per afferrare la membrana sul bordo tra la placenta e la regione riflessa. Utilizzare un bisturi per tagliare lungo la circonferenza della placenta e separare l'amnione placentare dal corione, facendo attenzione a non tagliare alcun recipiente dalla placenta. Posizionare il tessuto separato in un altro becher etichettato con 300 millilitri di soluzione salina.
E separare il resto della membrana amniotica che non è attaccata alla placenta dal corione. Quindi, posizionare la regione riflessa in un altro becher etichettato con 300 millilitri di soluzione salina. Per lavare le membrane, utilizzare una pinzetta per posizionarle su una superficie sterile per essere in grado di scartare la soluzione salina da ogni contenitore di tessuto.
Riposizionare le membrane nel contenitore e aggiungere 100 millilitri di soluzione salina fresca alla regione ombelicale e 300 millilitri di soluzione salina fresca alle regioni placentare e riflesse. Utilizzare le forcep di sezionamento per mescolare le membrane per rimuovere eventuali residui di sangue e posizionare le membrane sulla superficie sterile per poter scartare le soluzioni saline. Quindi, lavare le membrane almeno altre due volte, come appena dimostrato, fino a quando i tessuti non sono traslucidi.
Per la digestione enzimatica delle diverse regioni della membrana amniotica, tagliare le regioni riflesse e placentari in due o tre frammenti. E posizionare i frammenti e la regione ombelicale in singoli tubi di centrifuga da 50 millilitri. Aggiungere 20 millilitri dello 0,5% di tripsiderina-EDTA a ciascun tubo di frammenti di tessuto della regione riflessa e placentare e cinque millilitri dello 0,5% di tripside-EDTA al tubo contenente il tessuto della regione ombelicale.
Agitare delicatamente i tubi per 30 secondi. Quindi posizionare le membrane su una superficie sterile, scartando la soluzione di tripina-EDTA e sostituirla con 30 millilitri di fresco 0,5% di tripsiderina-EDTA per i frammenti di tessuto della regione riflessa e placentare e 15 millilitri di fresco 0,5%Tripside-EDTA per il tessuto della regione ombelicale. Quindi posizionare i tubi in un rotatore all'interno di un incubatore per una rotazione di 40 minuti a 20 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, trasferire l'intero volume della soluzione cellulare in nuovi tubi conici. E aggiungere due volte il volume di cellule AE umane di 37 gradi Celsius medie ad ogni tubo sul ghiaccio. Digerire eventuali frammenti di tessuto rimanenti nei tubi originali con fresco 0,5% di tripside-EDTA, come appena dimostrato.
Alla fine della seconda digestione, utilizzare un paio di forcelle dissezionanti per tenere un'estremità della porzione di amniion e una seconda coppia di forcelle di sezionamento per spremere lungo il tessuto rimanente per rimuovere eventuali file di cellule epiteliali che non si sono completamente staccate durante i precedenti periodi di incubazione. Quindi, rimuovere le membrane per poter trasferire la seconda soluzione di digestione in un secondo set di tubi di centrifuga. E inattivare gli enzimi di digestione con due volte il volume del mezzo cellulare AE umano fresco di 37 gradi Celsius sul ghiaccio.
Per l'isolamento delle cellule AE umane, sedimentare le cellule per centrifugazione. E rimescolare il pellet in ogni tubo con 10 millilitri di mezzo cellulare AE umano fresco di 37 gradi Celsius. Tirare ogni coppia di digestione in un unico tubo e filtrare le sospensioni attraverso filtri da 100 micrometri per rimuovere eventuali detriti della matrice extracellulare.
Dopo il conteggio, seminare le cellule AE umane da ciascuna delle tre regioni in singole piastre di 100 millimetri a una concentrazione di tre volte 10-quarta cella per centimetro al quadrato in mezzo cellulare AE umano di 37 gradi Celsius, integrata con 10 nanogrammi per millilitro del fattore di crescita epidermico umano. Quindi, incubare le colture a 37 gradi Celsius in condizioni normossiche in un incubatore umidificato fino all'analisi a valle dell'interesse. Dopo 48 ore di coltura, le cellule AE umane con un fenotipo epiteliale aderiscono alla superficie della piastra, mentre il supernatante contiene detriti cellulari e cellule galleggianti che possono essere rimosse una volta cambiato il mezzo.
Si consiglia di scartare le colture ed elaborare un'altra membrana identificando la presenza di contaminazione batterica, etitrociti eccessivi a causa di un lavaggio insufficiente delle membrane, delle cellule carenti o non aderenti o delle cellule con una morfologia fibroblastica. La morfologia delle cellule AE umane dipende dall'origine delle cellule, poiché le cellule della zona riflessa dimostrano una morfologia cuboidale e crescono in un monostrato acciottolato, e le cellule delle regioni placentare e ombelicali sono piatte e squamose. L'immunofluorescenza contro l'E-cadherina rivela che le colture primarie e le sottoculture mantengono il loro fenotipo epiteliale, suggerendo che non vi è contaminazione di un altro tipo di cellula.
Inoltre, le cellule sono vitali, come evidenziato dalla loro espressione del marcatore di proliferazione Ki-67. Sebbene le sottopopolazioni dall'amnione differiscano nella loro morfologia e funzione, l'espressione e la presenza del nucleo dei fattori di pluripotenza non cambia nelle cellule AE umane derivate dalle regioni placentari e riflesse. Poiché le cellule epiteliali amniotiche umane sono una possibile fonte di cellule staminali pluripotenti, possiamo sfidarle attraverso una linea di protocolli di definizione specifici per chiarire se queste cellule di ogni regione hanno potenzialità diverse.
Prima di un protocollo iniziato, rivedere la storia medica del paziente per essere sicuri che il tessuto non mostri caratteristiche microbiologiche dell'infezione.
