Poiché questo metodo determina le cellule legate agli anticorpi che bloccano il PD-1 utilizzando sangue periferico dei pazienti, è possibile identificare il sottoinsieme specifico responsabile degli effetti antitumorali e degli eventi avversi immunitari. Questo metodo ha bisogno solo di una piccola quantità di campione di sangue e il processo di analisi è abbastanza semplice e veloce. Ha solo bisogno di una macchina citometrica a flusso.
Per iniziare, raccogliere campioni di sangue intero in tubi di raccolta del sangue contenenti EDTA. Trattare ogni cinque millilitri tubo citometrico a flusso di polistirene inferiore rotondo con un millilitro di siero bovino fetale al 2% in PBS. Vortice per 10 secondi.
Quindi trasferire 20 microlitri di campioni di sangue intero ai tubi inferiori rotondi da cinque millilitri trattati. Aggiungere 20 microlitri di 2%FBS in PBS e 10 microlitri di reagente bloccante del recettore FC specifico per l'uomo. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi dei globuli rossi. Mescolare bene e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere quattro millilitri del 2%FBS in PBS e far girare le celle a 400 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Rimuovere il supernatante per aspirazione. Ripetere il processo di lavaggio e aspirazione. Rimospendare le celle in 100 microlitri del 2%FBS in PBS e dividersi in due tubi da 50 microlitri ciascuno.
Aggiungere anticorpi marcatori di superficie. Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio. Lavare i campioni due volte nel 2%FBS in PBS come in precedenza.
Rimosi le celle in 200 microlitri del 2%FBS in PBS. Inserire i tubi nel citometro di flusso e acquisire celle seguendo il protocollo consigliato. Registra 10.000 eventi come gate dei linfociti ed esporta i dati di flusso come file FCS per l'analisi.
Aprire i file nel software di analisi e fare clic sul file di controllo dell'isotipo per visualizzare le cellule su un grafico a dispersione in avanti rispetto alla dispersione laterale e ai linfociti di gate. Selezionare singole celle utilizzando FSCH rispetto a FSCW e SSCH rispetto a SSCW e visualizzarle su un grafico CD3 rispetto a CD8 o CD3 rispetto a CD4. Gate rispettivamente le celle T CD8 e CD4.
Selezionare le celle recingate e visualizzarle su un grafico IgG4 PD-1 rispetto a quello umano. Quindi, in base al controllo dell'isotipo, selezionate Q3 per identificare le cellule T CD8 e CD4 con blocco anticorpale PD-1. In questo studio, la strategia di gating e l'analisi della citometria del flusso hanno rilevato il legame anticorpo che blocca il PD-1 alle cellule T ottenuto da una goccia di sangue periferico del paziente.
Il grafico PD-1 contro IgG4 umano mostra lo stato di legame degli anticorpi che bloccano il PD-1 sulle cellule T. Punti arancioni e punti neri indicano rispettivamente la colorazione anticorpale anti-IgG4 e controllo dell'isotipo. Prima della somministrazione di anticorpi di blocco PD-1, non erano presenti cellule T positive IgG4 umane CD8 o CD4 e l'espressione PD-1 è stata confermata da un anticorpo di rilevamento PD-1.
Dopo la somministrazione di nivolumab o pembrolizumab, IgG4 può essere rilevato sulle cellule T da anticorpi anti-IgG4 mentre l'anticorpo di rilevamento PD-1 EH12.1 non riconosce alcun PD-1 sulle cellule T. I cancelli rosso, blu e verde indicano rispettivamente l'associazione completa, l'associazione parziale e la perdita dell'associazione. Dopo che i pazienti hanno interrotto nivolumab e pembrolizumab, lo stato dell'anticorpo che blocca il PD-1 si lega alle cellule T CD8 è diminuito.
C'è stata una parziale legatura e infine una completa perdita di binding. Assicurati di mescolare il campione di sangue anche con la llisi RBC. Inoltre, la miscelazione della lisi RBC prima della colorazione del marcatore di superficie è il passaggio chiave di questo metodo.
Se il ricercatore ha accesso a una macchina citometrica a flusso avanzato, le cellule T legate agli anticorpi PD-1 possono essere valutate con sempre più marcatori correlati a Questa strategia può essere applicata per profilare fenotipi di cellule T responsabili di eventi avversi causati da anticorpi di blocco PD-1. Il campionamento da pazienti con eventi avversi sviluppati è importante per valutare l'utilità di questa strategia.
