Questo protocollo descrive la preparazione e l'uso di embrioni di pollo tra il quinto e l'ottavo giorno di incubazione per l'imaging ecografico con mezzo di contrasto e studi di somministrazione di farmaci mediati da microbolle I tre metodi per estrarre il contenuto dal guscio d'uovo al giorno cinque o otto ne consentono lo sviluppo all'interno del guscio e richiedono solo strumenti di laboratorio di base. Questo modello è adatto per studiare diversi aspetti della ricerca ecografica e vascolare come l'imaging del flusso sanguigno, la somministrazione di farmaci e nuovi agenti di contrasto e trasduttori ad ultrasuoni. Per preparare un embrione di cinque giorni, posizionare un uovo fecondato incubato di cinque giorni in un portauova preriscaldato con l'uovo nello stesso orientamento dell'incubatrice e utilizzare il backend appuntito di una punta di pinzetta per fare una piccola rientranza sulla parte superiore dell'uovo.
Utilizzare le pinzette per fare una seconda rientranza sul lato dell'uovo circa 2/3 lungo la lunghezza dell'uovo e utilizzare un paio di pinzette più grandi per rimuovere un piccolo pezzo di guscio d'uovo dalla zona rientrante nella parte superiore dell'uovo, facendo attenzione che la sacca d'aria entri in contatto con l'aria ambiente senza penetrare troppo profondamente nel guscio. Utilizzando una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 19 penetrare nel guscio attraverso la seconda rientranza con l'ago rivolto verso il basso e prelevare circa due millilitri di albumina. Quando l'albumina è stata raccolta, utilizzare del nastro adesivo per sigillare la puntura e erogare l'albumina in una barca di pesatura.
Utilizzare le pinzette grandi per allargare la piccola apertura sulla parte superiore dell'uovo fino a quando l'embrione e la membrana corioallantoica sono completamente visibili senza rimuovere il guscio sotto la membrana corioallantoica o penetrare nella membrana interna. Quando è stata creata un'apertura sufficiente, ruotare l'uovo di 180 gradi all'interno del supporto in modo che l'apertura nella parte superiore dell'uovo sia ora rivolta verso il basso. Dopo uno o due minuti, l'embrione galleggerà, diventando invisibile dal basso.
Quando l'intero embrione e la membrana corioallantoica sono scomparsi dalla vista e solo il tuorlo è visibile, rimuovere il nastro dall'apertura laterale. L'interno dell'uovo dovrebbe sporgere dall'apertura. Mentre si tiene il fondo dell'uovo vicino alla barca di pesatura nel supporto del battello di pesatura in metallo, utilizzare le punte acuminate delle piccole pinzette per fare un graffio orizzontale delicatamente ma rapidamente nella membrana su tutta la larghezza dell'apertura e far cadere delicatamente il contenuto dell'uovo nella barca di pesatura.
Controlla se il battito cardiaco è ancora presente per confermare che l'embrione è ancora vivo, i vasi della membrana corioallantoica sono intatti e non ci sono perdite di sangue o tuorlo. Posizionare l'embrione vitale a 37 gradi Celsius con somministrazione regolare di gocce da 30 microlitri di PBS a 37 gradi Celsius all'embrione e alla membrana corioallantoica. Per raccogliere un embrione di sei-sette giorni e una membrana corioallantoica, preparare l'uovo come dimostrato per un embrione di cinque giorni e utilizzare una nuova siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 19 per penetrare nel guscio attraverso la seconda rientranza con l'ago rivolto verso il basso per prelevare da cinque a sei millilitri di albumina in una singola penetrazione.
Quando l'albumina è stata raccolta, inserire l'ago di una siringa da 10 millilitri contenente circa un millilitro di 37 gradi Celsius PBS, più del volume prelevato, nel lato del guscio con l'ago rivolto verso il basso per sostituire l'albumina raccolta. Quindi, richiudere rapidamente lo spazio con un pezzo di nastro adesivo e terminare la lavorazione dell'uovo come dimostrato. Per raccogliere l'embrione e la membrana corioallantoica da un uovo fecondato di otto giorni, tenere l'uovo orizzontalmente, utilizzare l'estremità posteriore di un paio di grandi pinzette e fare una piccola rientranza circa a metà della lunghezza dell'uovo.
Fai piccole rientranze in uno schema ad anello a 360 gradi attorno allo spazio del guscio d'uovo a circa 10 millimetri di distanza. Quando tutte le rientranze sono state create, utilizzare l'estremità appuntita delle pinzette per rompere il guscio tra due delle rientranze e immergere completamente l'uovo in PBS a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Alla fine dell'incubazione, spostare l'uovo su una barca di pesatura nel PBS e posizionare entrambi i pollici nel foro grande per aprire delicatamente l'uovo, che dovrebbe rompersi lungo le piccole rientranze.
Quando la fessura si è formata attorno al guscio d'uovo, separare delicatamente i due lati, spostando delicatamente i pezzi avanti e indietro fino a quando il contenuto dell'uovo non viene separato dal guscio e lascia cadere il contenuto nella barca di pesatura. Sollevare lentamente la barca di pesatura contenente il contenuto dell'uovo dal PBS, inclinando leggermente la barca per rimuovere eventuali PBS in eccesso. Quindi, posizionare il battello di pesatura in un supporto per pesatori in metallo.
In questa fase, un cuore pulsante può essere visto nell'embrione. Per preparare un campione di embrione e membrana corioallantoica per l'imaging al microscopio, posizionare un supporto con una membrana acustica con agarosio sul fondo di una piastra di Petri contenente circa 500 millilitri di PBS a 37 gradi Celsius con lo strato di agarosio rivolto verso l'alto. Utilizzare piccole forbici per tagliare rapidamente la membrana del vitello in sei-sette tagli attorno all'intera membrana corioallantoica mentre si ruota la barca di pesatura per una migliore precisione e velocità.
Utilizzare un cucchiaio per raccogliere la membrana di ritaglio contenente l'embrione e la membrana corioallantoica e sollevare lentamente il cucchiaio per consentire l'ispezione visiva se la membrana di taglio contenente l'embrione e la membrana corioallantoica è ancora attaccata al resto della membrana del sacco vitellino. Inclinare leggermente il cucchiaio per eliminare il maggior numero possibile di tuorlo senza asciugare il tessuto e immergere la membrana ritagliata nel PBS nella capsula di Petri da un litro. Utilizzando piccole pinzette, afferrare e ruotare delicatamente un bordo della membrana per rimuovere qualsiasi tuorlo ancora attaccato prima di spostare la membrana sul supporto con la membrana acustica.
Utilizzare un perno per campioni di insetti per fissare la membrana agli angoli opposti del supporto ed evitare di perforare i vasi della membrana corioallantoica. Quando entrambi gli angoli sono stati fissati, sollevare e inclinare leggermente il supporto per eliminare la maggior parte del PBS e utilizzare le piccole pinzette per allungare e distribuire uniformemente la membrana sul supporto per consentire al resto della membrana di essere appuntato al supporto. Quando l'embrione è stato fissato, posizionare il supporto in una configurazione microscopica a 37 gradi Celsius e posizionare una membrana acusticamente e otticamente trasparente sulla regione di interesse sul campione per consentire la visualizzazione ottica dei vasi.
In questa analisi rappresentativa, sono stati rimossi embrioni e membrane corioallantoiche di cinque, sei, sette e otto giorni, come dimostrato. Non si possono osservare sanguinamenti o danni agli embrioni o alle membrane corioallantoiche, indicando che questi metodi possono essere utilizzati per raccogliere in sicurezza il contenuto di uova senza danneggiare l'embrione o i vasi della membrana corioallantoica. Durante l'estrazione possono verificarsi molteplici complicazioni, quindi è importante seguire attentamente il protocollo e scartare eventuali campioni di tessuto danneggiati.
Come dimostrato, l'embrione può essere iniettato, ad esempio, con agenti di contrasto ad ultrasuoni come le microbolle. Al momento della consegna, le micro bolle possono essere osservate circolare all'interno del lume del vaso sanguigno iniettato e circolare all'interno del sangue periferico per diverse ore. Prima dell'iniezione di microbolle, il contrasto può già essere osservato all'interno del cuore embrionale dalla modalità B, ma non dall'imaging subarmonico ad ultrasuoni ad alta frequenza.
L'aggiunta di microbolle aumenta il contrasto e la visibilità dell'embrione in entrambi i tipi di immagini. Le immagini subarmoniche 3D ad alta frequenza possono anche essere ottenute dopo l'iniezione di agenti di contrasto per visualizzare le reti di vasi all'interno dell'embrione e della membrana corioallantoica. L'embrione di pollo e i vasi della membrana corioallantoica possono anche essere utilizzati per studiare la somministrazione di farmaci mediata da ultrasuoni.
Quando si tenta questa procedura, è molto importante mantenere sempre l'embrione e la CAM a 37 gradi Celsius e non lasciarlo asciugare. Seguendo questa procedura, l'embrione di pollo può essere collocato in diverse configurazioni, come un serbatoio d'acqua o un microscopio per eseguire l'imaging a ultrasuoni con mezzo di contrasto o studi di somministrazione di farmaci mediati da microbolle. Questo metodo e preparazione è adatto per gli studi sugli agenti di contrasto ad ultrasuoni e può essere utilizzato anche per la ricerca sul cancro e sui virus.
