Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare l'effetto di più enzimi di glicosilazione sul glico-profilo di una proteina bersaglio e contribuire a una migliore comprensione delle funzionalità dell'enzima. La natura del protocollo consente lo screening degli enzimi di glicosilazione in modo transitorio, ma ad alto rendimento. Profili di glicosilazione alterati possono portare a un miglioramento delle attività anticorpali e quindi aumentare l'efficacia del prodotto finale.
Le aziende biofarmaceutiche monitorano attentamente la glicosilazione come attributo critico di qualità. Una glicosilazione aberrante è un segno distintivo di malattie come il cancro. Pertanto, questo metodo è rilevante per la ricerca farmacologica e biomedica.
Il protocollo presuppone che gli utenti abbiano esperienza in diverse tecniche sperimentali, tra cui la trasfezione di cellule di mammifero e western blots. È meglio iniziare con meno campioni e utilizzare i punti di arresto in prima istanza. Inizia valutando la densità e la vitalità delle cellule ovariche del criceto cinese.
Quindi, pulire accuratamente l'armadio di biosicurezza e tutte le apparecchiature con etanolo al 70% e una soluzione di inibitore della RNasi per evitare la contaminazione. Quindi, pellet le celle a 100 volte G per cinque minuti e risospese in un mezzo preriscaldato ad una densità cellulare di cinque volte 10 alle sei celle per millilitro. Trasferire otto microlitri della miscela o del controllo principale DsiRNA in una cuvetta sterile per elettroporazione.
Aggiungere 800 microlitri della sospensione cellulare alla stessa cuvetta, mescolare ed erogare l'impulso di elettroporazione. Quindi, trasferire la sospensione cellulare dalla cuvetta a un pozzetto di una piastra a sei pozzetti, evitando materiale simile alla schiuma. Incubare le cellule per 10 minuti senza agitare.
Dopo l'incubazione, aggiungere 800 microlitri di mezzi preriscaldati per ottenere un volume finale di 1,6 millilitri per pozzetto. Far crescere le cellule trasfettate nell'incubatrice mentre si agita a 150 RPM. Dopo 48 ore, raccogliere il surnatante e le cellule.
Dopo la purificazione delle IgG, aggiungere l'eluizione A su un concentratore centrifugo a peso molecolare di tre kilodalton e centrifugare a 13.300 volte G per 40-50 minuti a quattro gradi Celsius. La centrifugazione è completa una volta che il volume residuo è pari o inferiore a 50 microlitri. Scartare il flusso attraverso e aggiungere 500 microlitri di PBS 1X pre-refrigerato per diluire il surnatante residuo.
Centrifugare nuovamente il campione utilizzando le stesse condizioni fino a quando rimangono 50 microlitri di surnatante residuo. Per ottenere una diluizione 100X del surnatante, aggiungere 500 microlitri di PBS 1X pre-refrigerato e ripetere il processo di centrifugazione. Concentrare il surnatante in una concentrazione finale di circa 2,5 grammi per litro in 40 microlitri per garantire la compatibilità con il metodo di analisi del glicano.
Per l'analisi del glicano, trasferire 200 microlitri della soluzione di perline magnetiche in un tubo PCR da 2 millilitri. Posizionalo sul supporto magnetico per separare le perline dal surnatante e rimuovere il surnatante con attenzione. Quindi, rimuovere i tubi dal supporto magnetico e aggiungere il campione proteico purificato e il vortice.
Quindi, aggiungere il tampone di denaturazione di alimentazione alla provetta del campione e incubare per otto minuti a 60 gradi Celsius. Tenere aperte le provette campione per prestazioni di reazione ottimali. Dopo l'incubazione, aggiungere PNGasi F e incubare per altri 20 minuti a 60 gradi Celsius per scindere i glicani dagli anticorpi purificati.
Dopo il rilascio di N-glicani, chiudere la provetta del campione e il vortice. Quindi, aggiungere acetonitrile alla provetta del campione, vortice e incubare a temperatura ambiente per un minuto. Posizionare le provette campione nel supporto magnetico per separare le perline dalla soluzione.
Quindi, usando una pipetta, rimuovere con cura il surnatante senza toccare le perline. Aggiungere la soluzione di etichettatura glicane contenente fluoroforo al campione in una cappa aspirante e mescolare vorticosamente. Dopo un'incubazione di 20 minuti a 60 gradi Celsius con coperchi aperti, rimuovere il colorante in eccesso lavando il campione tre volte in acetonitrile.
Quindi, eluire i glicani etichettati in acqua a doppio distillato. Posizionare la provetta nel supporto magnetico e raccogliere il surnatante arricchito con glicani purificati ed etichettati. Quindi, preparare e caricare tutti gli standard e i campioni richiesti nelle posizioni del vassoio designate.
Eseguire il protocollo di analisi dei glicani e analizzare e identificare i glicani presenti nel campione utilizzando un software appropriato. L'analisi Western blot ha mostrato una ridotta espressione della proteina Fut8 nelle cellule trasfettate con una miscela di tre costrutti fut8 DsiRNA. Anche le strutture glicaniche delle cellule abbattute hanno mostrato una diminuzione della fucosilazione.
Questa tendenza è stata più pronunciata nelle strutture agalattosilate e osservata in misura minore nelle strutture galattosilate. Una riduzione di due volte della fucosilazione del nucleo è stata osservata dall'elettroporazione utilizzando due impulsi a onda quadra rispetto a un singolo impulso a onda quadra senza differenze significative nella vitalità cellulare. Nel complesso, l'aumento della concentrazione di RNA a breve interferenza ha una grande interferenza sulla fucosilazione del nucleo rispetto all'aumento del tempo di raccolta.
Il rapporto tra acqua e acetonitrile determina se i glicani sono in soluzione o parte delle perline. Questo è fondamentale da ricordare durante le fasi di lavaggio per evitare la rimozione accidentale dei glicani etichettati dalla soluzione. Un esperimento di follow-up potrebbe comportare la caratterizzazione di anticorpi monoclonali purificati utilizzando saggi basati su cellule per quantificare la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente e la citotossicità complemento-dipendente.
