Questo protocollo consente la semplice generazione di reti di nanotubi lipidici su larga scala in cui i singoli nanotubi mostrano un comportamento di separazione di fase simile a quello della vescicola genitore. Il vantaggio principale di questo approccio è che cooptiamo il lavoro svolto dai motori molecolari per auto-assemblare i nanotubi lipidici in modo altamente parallelo e senza l'intervento umano. Per impostare un test di motilità di scorrimento, in primo luogo, apporre tre serie di strisce di nastro biadesivo su una slitta di vetro a cinque millimetri di distanza.
Premere delicatamente un coperchio scivolare sul nastro e aggiungere 30 microlitri di una soluzione di kinesina monoparolare nella cella di flusso preparata. Dopo cinque minuti, aggiungere 30 microlitri di una soluzione di microtubuli da 10 microgrammi/millilitro nella cella, premendo delicatamente una salvietta da laboratorio contro l'estremità opposta del canale di flusso per facilitare lo scambio di soluzione. Dopo altri cinque minuti di incubazione, lavare la cella da una a tre volte con 50 microlitri di soluzione di motilità a temperatura ambiente per lavaggio prima di aggiungere 30 microlitri di soluzione di streptavidina da 10 microgrammi / millilitro alla cella di flusso.
Dopo 10 minuti, aggiungere 30 microlitri di una soluzione 10X GUV per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere due microlitri di una soluzione AMP-PNP da 100 millimolari e chiudere la camera con sigillante. Trasferire la camera di flusso su un microscopio invertito per l'imaging e selezionare il set di filtri appropriato.
Utilizzare un obiettivo a olio 100X per mettere a fuoco prima la superficie dello slittamento del coperchio prima di acquisire un'immagine di una rete di interesse. Quindi aprire l'immagine in ImageJ e fare clic su Immagine, Colore e Composito per sovrapporre i canali rosso e verde per creare un'immagine composita. Dopo l'imaging, apri l'immagine di interesse e fai clic su Analizza e imposta scala per calibrare la scala per il microscopio.
Inserisci i pixel fino al fattore di conversione del micrometro e fai clic su OK. Utilizzare lo strumento linea multipunto per tracciare i nanotubi a partire dal GUV padre e tenere premuti Ctrl e M per misurare la lunghezza. Lo strumento di elaborazione delle immagini salverà ogni nuova misurazione nella finestra dei risultati. Quando tutti i tubi sono stati misurati, selezionare Immagine, Regola e Soglia e fare clic su Applica per applicare la soglia.
Quindi, disegnare un rettangolo di lunghezza nota sul tubo desiderato. Per misurare la densità integrata dell'area, fare clic su Analizza e misura Per determinare il partizionamento lipidico nei nodi dei nanotubi liquidi, utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea sul nodo di interesse e misurare l'intensità del nodo sia nei canali verde che rosso. In questa analisi rappresentativa, sono state fabbricate reti di nanotubi liquidi come dimostrato per generare fasi disordinate e ordinate liquide, nonché vescicole separate da fasi.
Ad esempio, le vescicole sintetizzate con il 45% di lipidi saturi e il 55% di lipidi insaturi si traducono in vescicole che si separano in fasi liquide-disordinate e solide coesistenti. Se si include il colesterolo, tuttavia, si può quindi osservare la coesistenza liquido-liquido, creando GUV che si separano in fasi coesistenti ordinate liquide e liquido-disordinate. Inoltre, i nodi possono essere osservati all'interno delle miscele separate da fase.
La cosa più importante da ricordare è scegliere il tempo di esposizione appropriato e il set di filtri ND per poter visualizzare i nanotubi lipidici senza foto-sbiancare i fluorofori. Personalizzare la composizione del comportamento di fase dei nanotubi lipidici ci consente di utilizzare un sistema di modelli minimalisti per iniziare a studiare la biofisica dei nanotubi di tunneling che collegano le cellule.
