Ringraziamo Melissa Klocke per l&#39;assistenza preparare la figura 1 e Anna Ratliff per dimostrare il protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto dal Research Corporation per il Progresso della Scienza.

1. Microtubuli Gliding scorta di saggio Solutions Preparare in anticipo dosaggio volo a vela. <ol><li> Polimerizzare microtubuli 0,5 mg scarsamente etichettati con brillante organico fluoroforo 22. La concentrazione etichetta di destinazione è 1 fluoroforo per micrometro di microtubuli, etichettatura o una densità di circa 1 fluoroforo per 1.500 dimeri di tubulina. Conservare a temperatura ambiente, la luce protetta con alluminio, pellicola per un massimo di due settimane. </li><li> Purificare biotina-chinesina 21 a circa 1 pM. Conservare a -80 ° C in aliquote di 5 microlitri per uso in esperimenti singoli. </li><li> Preparare il tampone di saggio (AB) di 50 imidiazole mM, 50 mM di cloruro di potassio (KCl), 4 mM di cloruro di magnesio (MgCl 2), 2 mM di etilene glicole tetraacetico (EGTA), pH 6,7. Filtro sterile e conservare a 4 ° C. </li><li> Sciogliere biotinilato albumina di siero bovino (biotina-BSA) a 2 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa.Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 microlitri per lunghi periodi, a 4 ° C per un mese. </li><li> Sciogliere streptavidina (SA) a 10 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in 20 aliquote pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li><li> Sciogliere α-caseina a 5 mg / ml in AB. Filtro con 0,2 micron filtro siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote di 100 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li><li> Sciogliere ditiotreitolo (DTT) in acqua deionizzata a 200 mM. Conservare a -20 ° C in aliquote di 100 pl, da usare entro 8 ore di scongelamento. Può essere ricongelato. </li><li> Sciogliere paclitaxel (PT) in grado HPLC dimetilsolfossido (DMSO) a 4 mM. Conservare in aliquote da 10 pl a -80 ° C lungo termine, -20 ° C a breve termine. Utilizzare entro 8 ore dallo scongelamento. Può essere ricongelato. </li><li> Sciogliere il glucosio in acqua deionizzata a 120 mg / ml. Conservare in aliquote di 100 pl a -20 ° C. Può essere ricongelato. </li><li> Disrisolvere adenosina trifosfato (ATP) in acqua deionizzata a 150 mM, pH 7,0. Conservare in aliquote di 5 pl a -80 ° C, da usare entro 8 ore di scongelamento. </li><li> Preparare 100x magazzino l&#39;assorbimento di ossigeno 25, sciogliendo 10.000 unità di glucosio ossidasi e catalasi 156.000 unità in 600 microlitri di buffer totale del saggio. Centrifugare brevemente in una microcentrifuga per far sedimentare i solidi; sopranatante filtro con filtro 0,2 micron siringa. Conservare a -80 ° C in aliquote da 10 pl per lunghi periodi, a 4 ° C per una settimana. </li></ol> 2. Microtubuli Gliding Assay, in giornata Soluzione Preparazione Preparare le soluzioni in 2,1-2,6 il giorno dell&#39;esperimento. Con la pratica, le soluzioni 2,2-2,6 può essere preparato durante la cella a flusso di lavaggio. Se non diversamente specificato, mantenere le soluzioni di archivi su ghiaccio. <ol><li> Preparare AB, 1 ml di tampone con 10 ml di DTT magazzino (AB con 2 mM DTT). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare bio-BSA, 40 e mu, L di una miscela 1:1 di biotina-BSA magazzino e AB. Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare tampone BSA, mescolando 645 ml di AB 5,5 microlitri con BSA (1 mg / ml di BSA in AB). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare tampone SA, mescolando 57 ml di AB con 3 stock microlitri streptavidina (0,5 mg / ml di streptavidina in AB). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare α-caseina buffer, mescolando 200 ml di BSA, 50 microlitri archivio di caseina, e 0,8 pl di ATP 15 mM (1 mg / ml α-caseina, 0,8 mg / ml BSA, 50 nM ATP in AB). Conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare fluorescenza anti-candeggina tampone, mescolando 95 microlitri α-caseina tampone, 2,5 microlitri archivio di glucosio, 1 mix microlitri ossigeno 100x scavenging, 1 stock paclitaxel pl, 1 ml 2-mercaptoetanolo (βME). Aggiungi βME sotto cappa d&#39;aspirazione. Utilizzare fluorescenza anti-candeggina buffer entro 1 ora di preparazione. ATTENZIONE: βME è altamente tossico e odori terribili. Assicurarsi di aprire solo sotto la cappa aspirante. Conservare nella bottigliaassenza di luce, la luce degrada βME e la sua capacità di ridurre photobleaching. </li></ol> 3. Microtubuli Gliding Assay <ol><li> Costruire circa quattro corsie di flusso tra un x 24 60 coprioggetto mm e 22 x 22 mm con l&#39;utilizzo coprioggetto grasso per vuoto, estrusi da una siringa attraverso un puntale, come un distanziatore. Ogni corsia flusso deve essere di circa 10 microlitri di volume (scala volumi successivi di conseguenza). </li><li> Lavare 10 pl di bio-BSA buffer in ogni corsia. Incubare 5 min per permettere BSA per rivestire le superfici di vetro. </li><li> Lavare ogni corsia tre volte con 15 microlitri tampone BSA per rimuovere libera biotina-BSA, pur continuando a bloccare la superficie di scorrimento. Utilizzare un Kimwipe o carta da filtro per rimuovere il tampone dal lato opposto della camera di flusso, assicurandosi di non lasciare bolle d&#39;aria di passare attraverso la camera di flusso. </li><li> Lavare 15 microlitri SA-buffer in ogni corsia. Attendere 10 minuti, o fino a 2 ore. La streptavidina si legano alla superficie è legato biotina-BSA. </li><li> Lavare ogni corsia per tre volte con 15 microlitri di buffer BSA per rimuovere libero SA, pur continuando a bloccare la superficie del vetrino. </li><li> Lavare ogni corsia con 15 microlitri α-caseina buffer. α-caseina aiuta ulteriormente bloccare il legame non specifico di chinesina e microtubuli al vetro. </li><li> Diluire chinesina a 10 nM in α-caseina tampone e lavare ogni corsia con 15 pl di questo chinesina - α-caseina soluzione. Attendere 15 minuti (o fino ad un&#39;ora) per la cinesina biotinilato di legarsi specificamente alla superficie è legato il streptavidina. I domini motore chinesina resteranno liberi di microtubuli si legano. </li><li> Diluire paclitaxel a 40 pM a temperatura ambiente α-caseina tampone, e lavare ogni corsia con 15 pl di questa soluzione per lavare chinesina libero e per pre-caricare ogni camera di flusso con una soluzione di paclitaxel per impedire microtubuli dai depolimerizzante. Freddo depolimerizza anche microtubuli, in modo da assicurarsi che questi passaggi avvengono a temperatura ambiente con temperature ambienteri soluzioni. </li><li> Diluire il marcato in modo fluorescente microtubuli 1:100-1:1,000 della fluorescenza anti-candeggina buffer con 1 mM ATP. Lavare 15 microlitri in una corsia ed osservare entro 30 min. </li></ol> 4. Raccolta dei dati <ol><li> Osservare il volo a vela microtubuli mediante microscopia a fluorescenza, un microscopio in grado di risolvere fluorofori singoli come un setup commerciale o casa-build TIRF è richiesto 26 (Figura 2). I microtubuli devono essere azionati da motori chinesina sul substrato a circa 0,5 micron / s, a seconda della temperatura. Se il campo di vista del microscopio è 50 pm, microtubuli singoli dovrebbero essere visibili per circa 100 sec. Impostare l&#39;intensità di illuminazione in modo che singoli fluorofori non fotosbiancante più velocemente di 100 sec. Se si utilizza eccitazione laser, un livello di potenza di circa 3-5 mW è appropriato. </li><li> Raccogliere sequenze di immagini per l&#39;analisi. 600 immagini a5 Hz (2 totale min) funziona bene. Utilizzare sequenze abbastanza a lungo microtubuli che attraversano l&#39;intero campo di vista. </li></ol> 5. Analisi dei dati Una routine IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , è allegato. Questa routine restituisce un valore di lunghezza di persistenza sulla base di tutte planata microtubuli in una sequenza data immagine. O eseguire questa routine su ogni sequenza di immagini, modificare i parametri di intensità a seconda della configurazione del microscopio particolare, o di effettuare le seguenti operazioni: <ol><li> Traccia ogni fluoroforo collegato a un microtubulo per creare traiettorie fluorofori. </li><li> Combinare tutte le traiettorie di fluorofori su un microtubulo data in una traiettoria complessiva microtubuli; ripetere per ogni microtubule nella sequenza di immagini (Figura 3). </li><li> Calcolare l&#39;angolo tangente ad ogni punto lungo la traiettoria (Figura 4), E calcolare &lt;cos θ s&gt; nell&#39;eq. 1 mediando il coseno della differenza di angolo per ogni coppia di punti separati da un percorso di lunghezza s (Figura 5). Trovare la lunghezza di persistenza di un microtubulo o un gruppo di microtubuli &lt;cos montaggio θ s&gt; a Eq. 1, ponderazione singoli punti dati nella forma per il numero di valori indipendenti di cos θ s che sono utilizzati per calcolare la media. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Misure di lunghezza persistenza sono una buona caratterizzazione delle proprietà meccaniche dei biopolimeri singoli. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli. Come detto nell&#39;introduzione, questo metodo è facilmente esteso ad esaminare le proprietà meccaniche microtubuli in una varietà di condizioni semplicemente variando i reagenti, temperatura o viscosità nella fase finale del saggio planata, 3,9, o da microtubuli polimerizzanti, passo 1,1, in co...

Il citoscheletro, una rete di biopolimeri presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche, svolge un ruolo nella organizzazione cellulare, trasporto intracellulare, e meccanica delle cellule. Le caratteristiche meccaniche dei biopolimeri del citoscheletro (principalmente actina e microtubuli) svolgono un ruolo significativo nel determinare le caratteristiche meccaniche della cellula nel suo complesso 12. Poiché meccanica cellule intere possono caratterizzare cellule sane e malate 13,14 ed è coinvolto nella motilità cellulare 15, le proprietà meccaniche dei componenti citoscheletrici sottostanti sono un&#39;area attiva di studio per gli ultimi due decenni 1. La flessibilità (o rigidità) di biopolimeri è caratterizzato dalla lunghezza di persistenza, la lunghezza del polimero che si piega per circa un radianti sotto fluttuazioni termiche a temperatura ambiente. Un certo numero di tecniche sono state sviluppate per misurare la lunghezza di persistenza 16, per exampLe tecniche attive che coinvolgono piegare il polimero attraverso il flusso idrodinamico, trappole ottiche, o campi elettrici 4,17,18, e tecniche passive che misurano le fluttuazioni di polimeri libere in soluzione 5,6. Le misurazioni attivi, tuttavia, richiedono configurazioni specializzate per implementare forze note sulla scala del micrometro, e le misurazioni di fluttuazione libera può essere difficile a causa della diffusione di piano focale del microscopio utilizzato. In questo articolo, si descrive un complementare, passiva, tecnica per misurare la lunghezza di persistenza dei microtubuli, un polimero del citoscheletro. La tecnica prevede saggi volo a vela, che assicurano che il polimero rimane sempre nel piano focale 19. Inoltre, esso comporta il rilevamento fluorofori singoli collegati in modo permanente al polimero di interesse, in modo che punti specifici lungo il polimero sono ben caratterizzati. Un cartone animato del metodo è illustrato nella Figure 1. Kinesina si muove in particolare verso la fine + di microtubuli, in modo che i microtubuli in un test di volo a vela sono spinti unidirezionale. L&#39;estremità anteriore del microtubulo, oltre l&#39;ultima chinesina collegato, è libero di fluttuare sotto le forze termici della soluzione circostante. Come il microtubulo viene spinto in avanti, fino alla fine oscilla legarsi a una molecola chinesina nuovo più avanti lungo il vetrino si congela in una fluttuazione dato. Poiché chinesina attribuisce microtubuli fortemente, la microtubuli è costretto a seguire il percorso della estremità anteriore. Pertanto, le fluttuazioni statistiche congelati nella traiettoria microtubuli sono le stesse delle fluttuazioni statistiche della estremità libera 11 microtubuli, e può quindi essere utilizzata per calcolare la lunghezza di persistenza secondo 20 <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src = &quot;/ files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg&quot; /&gt; dove L è la lunghezza p persistenza del microtubulo, s θ è l&#39;angolo tra tangenti alla traiettoria separate da una lunghezza s contorno, e &lt;&gt; indica una media di tutte le coppie di posizioni separate da una lunghezza s contorno. Il saggio di scorrimento si utilizza chinesina biotinilato al coiled-coil 21 legato specificamente al vetrino tramite una streptavidina-biotina linkage. Questo accessorio assicura che i domini motore sono liberi di legarsi ai microtubuli e spingere. Al fine di seguire traiettorie microtubuli, microtubuli sono scarsamente etichettati con fluorofori organici 22,23 - le etichette devono essere sparso abbastanza fluorofori singoli sono risolvibili utilizzando singola molecola microscopia a fluorescenza. Fluorofori singole sono monitorati tramite routine di analisi di immagini scritte in IDL. Le traiettorie di ciascun fluoroforo legato ad un determinato microfonorotubule sono combinati in una traiettoria microtubulo automaticamente composito 24. Gli angoli θ tangente ad ogni punto lungo una traiettoria vengono calcolati; da questi angoli tangenti l&#39;&lt;cosθ s&gt; valore viene calcolato per ogni s lunghezza dei contorni. Infine, questi dati sono idonei a Eq. 1 in modo da estrarre una lunghezza di persistenza per un determinato microtubulo, o per molti microtubuli nello stesso dosaggio scorrimento. Il metodo è abbastanza robusta per lavorare con microtubuli preparati in una varietà di condizioni (con differenti agenti stabilizzanti o altre piccole molecole legate al microtubulo, con proteine ​​legate associati microtubuli (MAP), o con una varietà di soluzioni viscose). Nel nostro laboratorio, la tecnica è stata utilizzata per caratterizzare la lunghezza di persistenza dei microtubuli in funzione della lunghezza lungo i microtubuli ei microtubuli con diversi agenti stabilizzanti. La limitazione principale è che i microtubuli devono ancora sOSTEGNO chinesina motilità. Poiché chinesina è un enzima motore robusto, questa è una restrizione abbastanza sciolto. Sostituendo con actina e microtubuli chinesina con un enzima famiglia miosina, la lunghezza di persistenza di actina può essere misurata utilizzando la stessa tecnica.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Reagenti</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imidazolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; I2399</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro di potassio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; P9541</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cloruro di magnesio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M8266</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BSA</td&gt;<td&gt; Calbiochem</td&gt;<td&gt; 126615</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Biotinilato BSA</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 29130</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Α-caseina</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C6780</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Streptavidina</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 21125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Ditiotreitolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; D0632</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Paclitaxel</td&gt;<td&gt; LC Laboratori</td&gt;<td&gt; P-9600</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosio ossidasi</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G2133</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Catalasi</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; C100</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucosio</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; G8270</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ATP</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; A2383</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 2-mercaptoetanolo</td&gt;<td&gt; Sigma-Aldrich</td&gt;<td&gt; M3148</td&gt;<td&gt; Toxic. Acquista piccola quantità.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24x60 mm N ° 1 1/2 bicchiere di copertura</td&gt;<td&gt; VWR</td&gt;<td&gt; 48393-252</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 22X22 mm N ° 1 bicchiere di copertura</td&gt;<td&gt; Gold Seal</td&gt;<td&gt; 3306</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Grasso per alto vuoto</td&gt;<td&gt; Dow-Corning</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td<strong&gt; Attrezzatura</strong&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TIRF microscopio</td&gt;<td&gt; Molti</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Il microscopio TIRF utilizzato in questo metodo è stato fatto in casa.</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; IDL (software)</td&gt;<td&gt; Exelis</td&gt;<td&gt; NA</td&gt;<td&gt; Potrebbe sostituire MATLAB, ImageJ, o altri software di analisi dell&#39;immagine.</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

flexural rigidity measurements of biopolymers using gliding assays

I microtubuli sono polimeri del citoscheletro che svolgono un ruolo nella divisione cellulare, cellulari, meccanica e mezzi di trasporto intracellulare. Ciascuna di queste funzioni richiede microtubuli che sono rigidi e dritti abbastanza per occupare una frazione significativa del diametro della cellula. Come risultato, la lunghezza di persistenza microtubuli, una misura della rigidità, è attivamente studiati negli ultimi due decenni 1. Tuttavia, restano questioni aperte: microtubuli brevi sono 10-50 volte meno rigido rispetto microtubuli lunghi 2-4, e anche lungo i microtubuli hanno misurato lunghezze persistenza che variano da un ordine di grandezza 5-9. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare la persistenza lunghezza microtubuli. Il metodo si basa su un saggio microtubuli chinesina-driven scorrimento 10. Grazie alla combinazione di scarsa marcatura fluorescente dei microtubuli singoli con servizio di monitoraggio singola particella di fluorofori singoli collegati al microtubulo, il Glidintraiettorie g di microtubuli singoli vengono tracciati con precisione a livello di nanometri. La lunghezza di persistenza delle traiettorie è uguale alla lunghezza di persistenza del microtubulo nelle condizioni utilizzate 11. Una routine di rilevamento automatico viene utilizzato per creare traiettorie microtubuli da fluorofori collegati microtubuli singoli, e la lunghezza di persistenza di tale traiettoria è calcolata utilizzando routine scritte in IDL. Questa tecnica è attuabile rapidamente, e in grado di misurare la lunghezza di persistenza di 100 microtubuli in un giorno di sperimentazione. Il metodo può essere esteso per misurare la lunghezza di persistenza sotto una varietà di condizioni, tra lunghezza di persistenza in funzione della lunghezza lungo i microtubuli. Inoltre, le routine di analisi utilizzate può essere esteso a miosina basati azione saggi scorrimento, per misurare la lunghezza di persistenza dei filamenti di actina pure.

Un&#39;istantanea da un saggio scorrimento è mostrato in Figura 2. Una buona densità microtubuli è microtubuli 1-10 per campo; sostanzialmente più provocherà sbandamento come microtubuli incrociano. Un grafico delle traiettorie 11 microtubuli del dosaggio scorrimento in figura 2 è mostrato in Figura 3. Traiettorie tipiche sono 10-30 micron di lunghezza, alcune traiettorie presentano spazi vuoti dove si incrocia un altro microtubuli. Tali traiettorie possono essere...

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Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

Misure rigidezza flessionale di biopolimeri usando saggi Gliding

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.7K Views.  Lawrence University. Un metodo per misurare la lunghezza di persistenza o rigidezza flessionale di biopolimeri è descritto. Il metodo utilizza una chinesina-driven saggio microtubuli planata per determinare sperimentalmente la lunghezza di persistenza di microtubuli singoli ed è adattabile a actina saggi basati scorrimento.

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Developing Custom Chinese Hamster Ovary-host Cell Protein Assays using Acoustic Membrane Microparticle Technology

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to the complexity of development on alternate platforms. BioScale's proprietary Acoustic Membrane MicroParticle (AMMP) technology allows sandwich immunoassays to be easily developed for use on the ViBE platform, providing better sensitivity, reproducibility, and automated operation. Provided as an example, this protocol outlines the procedure for developing a custom Chinese Hamster Ovary- Host Cell Protein (CHO-HCP) assay. The general principles outlined here can be followed for the development of a wide variety of immunoassays.
An AMMP assay measures antigen concentration by measuring changes in oscillation frequency caused by the binding of microparticles to the sensor surface to calculate. It consists of four major components: (1) a cartridge that contains a functionalized eight sensor chip (2) antibody labeled magnetic microparticles, (3) hapten tagged antibody that binds to the surface of the functionalized chip (4) samples containing the antigen of interest. BioScale's biosensor is a resonant device that contains eight individual membranes with separate fluidic paths. The membranes change oscillation frequency in response to mass accumulating on the surface and this frequency change is used to quantitate the amount of added mass.
To facilitate use in a wide variety of immunoassays the sensor is functionalized with an anti-hapten antibody. Assay specific antibodies are modified through the covalent conjugation of a hapten tag to one antibody and biotin to the other. The biotin label is used to bind the antibody to streptavidin coupled magnetic beads which, in combination with the hapten-tagged antibody, are used to capture the analyte in a sandwich. The complex binds to the chip through the anti-hapten/hapten interaction. At the end of each assay run the sensors are cleaned with a dilute acid enabling the sequential analysis of columns from a 96-well plate.
Here, we present the method for developing a custom CHO-HCP AMMP assay for bioprocess development. Developing AMMP assays or modifying existing assays into AMMP assays can provide better performance (reproducibility, sensitivity) in complex samples and reduced operator time. The protocol shows the steps for development and the discussion section reviews representative results. For a more in-depth explanation of assay optimization and customization parameters contact BioScale. This kit offers generic bioprocess development assays such as Residual Protein A, Product titer, and CHO-HCP.

Development of custom assays on the ViBE platform for more sensitive, reproducible, automated results in complex matrices is described. The universal cartridge allows assays to be easily adapted for use with custom assays. This versatility enables rapid development and validation of novel assays or automated versions of existing manual assays, exemplified in this video.

Sviluppo di ovaio di criceto cinese-dosaggi delle proteine ​​della cellula ospite con la tecnologia Acoustic microparticelle di membrana

Custom assays for unique proteins are often limited to time consuming manual detection and quantitation techniques such as ELISA or Western blots due to ...

Ricerca

Bioingegneria

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Micro-Particle Image Velocimetry per Velocity Misure profilo dei flussi Micro sangue

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

Perlina di aggregazione saggi per la caratterizzazione di molecole di adesione cellulare putativo

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Molecolare Entanglement e Electrospinnability di biopolimeri

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and macro-structures, as seen in the cases of moving water in vascular bundles and moisturizing water in skin layers. In this study, we developed a method for assessing the effect of aqueous liquid crystalline (LC) solutions composed of biopolymers on drying. As LC biopolymers have megamolecular weight, we chose to study polysaccharides, cytoskeletal proteins, and DNA. The observation of biopolymer solutions during drying under polarized light reveals milliscale self-integration starting from the unstable air-LC interface. The dynamics of the aqueous LC biopolymer solutions can be monitored by evaporating water from a one-side-open cell. By analyzing the images taken using cross-polarized light, it is possible to recognize the spatio-temporal changes in the orientational order parameter. This method can be useful for the characterization of not only artificial materials in various fields, but also natural living tissues. We believe that it will provide an evaluation method for soft materials in the biomedical and environmental fields.

A method for the drying-induced self-integration of megamolecular biopolymers on the air-liquid crystalline interface is provided here. This methodology will be useful not only for understanding the macroscopic potentials of biopolymers, but also as an evaluation method for soft materials in biomedical and environmental fields.

Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Power Input Measurements in Stirred Bioreactors at Laboratory Scale

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. However, the experimental determination of the power input in small-scale vessels is still challenging due to relatively high friction losses inside typically used bushings, bearings and/or shaft seals and the accuracy of commercially available torque meters. Thus, only limited data for small-scale bioreactors, in particular single-use systems, is available in the literature, making comparisons among different single-use systems and their conventional counterparts difficult.
This manuscript provides a protocol on how to measure power inputs in benchtop scale bioreactors over a wide range of turbulence conditions, which can be described by the dimensionless Reynolds number (Re). The aforementioned friction losses are effectively reduced by the use of an air bearing. The procedure on how to set up, conduct and evaluate a torque-based power input measurement, with special focus on cell culture typical agitation conditions with low to moderate turbulence (100 &#60; Re &#60; 2&#183;104), is described in detail. The power input of several multi-use and single-use bioreactors is provided by the dimensionless power number (also called Newton number, P0), which is determined to be in the range of P0 &#8776; 0.3 and P0 &#8776; 4.5 for the maximum Reynolds numbers in the different bioreactors.

The power input in stirred bioreactors can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during rotation. This manuscript describes how an air bearing can be used to effectively reduce friction losses observed in mechanical seals and improve the accuracy of power input measurements in small-scale vessels.

Misure di potenza ingresso in bioreattori agitate a scala di laboratorio

The power input in stirred bioreactors is an important scaling-up parameter and can be measured through the torque that acts on the impeller shaft during ...

A Millimeter Scale Flexural Testing System for Measuring the Mechanical Properties of Marine Sponge Spicules

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the flexural behavior of these LBBSs is important for understanding the origins of their remarkable mechanical functions.
We describe a protocol for performing three-point bending tests using a custom-built mechanical testing device that can measure forces ranging from 10-5 to 101 N and displacements ranging from 10-7 to 10-2 m. The primary advantage of this mechanical testing device is that the force and displacement capacities can be easily adjusted for different LBBSs. The device&#39;s operating principle is similar to that of an atomic force microscope. Namely, force is applied to the LBBS by a load point that is attached to the end of a cantilever. The load point displacement is measured by a fiber optic displacement sensor and converted into a force using the measured cantilever stiffness. The device&#39;s force range can be adjusted by using cantilevers of different stiffnesses.
The device&#39;s capabilities are demonstrated by performing three-point bending tests on the skeletal elements of the marine sponge Euplectella aspergillum. The skeletal elements&#8212;known as spicules&#8212;are silica fibers that are approximately 50 &#181;m in diameter. We describe the procedures for calibrating the mechanical testing device, mounting the spicules on a three-point bending fixture with a &#8776;1.3 mm span, and performing a bending test. The force applied to the spicule and its deflection at the location of the applied force are measured.

We present a protocol for performing three-point bending tests on sub-millimeter scale fibers using a custom-built mechanical testing device. The device can measure forces ranging from 20 &#181;N up to 10 N and can therefore accommodate a variety of fiber sizes.

Un sistema di prova millimetro scala flessionale per misurare le proprietà meccaniche di spicole di spugna marina

Many load bearing biological structures (LBBSs)&#8212;such as feather rachises and spicules&#8212;are small (&#60;1 mm) but not microscopic. Measuring the ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.