La microfluidica è una tecnica emergente per la preparazione di liposomi di dimensioni di nanoparticelle tonnibili e con grande riproducibilità e scalabilità. Questo protocollo consente la produzione continua ad alta uscita di liposomi sensibili a bassa temperatura per il co-carico con un farmaco chemioterapico come la doxorubicina e un colorante fluorescente come il verde indocyanina. La preparazione cellulare utilizza principalmente un approccio dall'alto verso il basso come l'idratazione e l'estrusione del film lipidico.
Rimane difficile preparare lotti di grandi dimensioni e riproducibili per applicazioni cliniche. Un grande vantaggio della microfluidica è la capacità di gestire piccoli volumi liquidi con elevata controllabilità nello spazio e nel tempo mentre si opera in modo continuo e automatizzato. A dimostrare la procedura con Calvin Cheung saranno Guanglong Ma e Amalia Ruiz, i ricercatori post-dottorato del mio laboratorio.
Per assemblare le pompe delle siringhe, utilizzare il cavo di rete pompa-pompa per collegare la porta al computer della pompa della siringa secondaria alla porta di rete della pompa principale della siringa. Utilizzare il PC per pompare il cavo di rete per collegare la porta computer della pompa master alla porta seriale RS-232 del computer. Per assemblare il dispositivo microfluidico a spina di pesce staggard, utilizzare un dado e un ferrule per collegare i tubi a ciascuna delle entrate e uscite del dispositivo.
Quindi utilizzare un secondo dado e ferrule e un assieme di unione per convertire il terminale del tubo per entrambe le entrate in un luer femmina. Per impostare il software di controllo della pompa, utilizzare il pulsante di configurazione della pompa siringa per assegnare l'indirizzo della pompa principale della siringa e della pompa della siringa secondaria rispettivamente ad Ad:01 e Ad:02, quindi aprire il software di controllo della pompa sul computer. Le due pompe per siringhe devono essere rilevate automaticamente seguite da un suono di bieping.
Selezionare HSW Norm-Ject 5cc diametro uguale a 12,45 per assegnare il diametro a 12,45 millimetri. Impostare la velocità su 0,25 millilitri al minuto per la pompa uno e 0,75 millilitri al minuto per la pompa due. Impostare il volume su qualsiasi valore superiore a cinque millilitri e selezionare la modalità infusione per entrambe le pompe.
Quindi fare clic su Imposta per confermare le impostazioni. Per preparare una miscela lipidica ICG LTSL10 o LTSL10, utilizzare una siringa di blocco luer da cinque millilitri per prelevare un millilitro di miscela lipidica e un'altra siringa di blocco da cinque millilitri luer per prelevare almeno tre millilitri di soluzione di solfato di ammonio. Far scorrere la flangia della canna della siringa al fermo siringa della pompa per installare le siringhe caricate sulle pompe della siringa in posizione verticale e attaccare la flangia dello stantuffo della siringa al blocco pusher della pompa e avvolgere l'altra estremità del nastro riscaldante e la sonda di temperatura con il termostato intorno alla siringa contenente la soluzione lipidica.
Avvolgere l'estremità del nastro riscaldante alla siringa contenente la soluzione acquosa, collegare la siringa contenente la miscela lipidica all'ingresso di etanolo e collegare la siringa contenente la soluzione di solfato di ammonio all'ingresso acquoso. Regolare la posizione dello stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria dalle siringhe in base alle esigenze e collegare e scollegare il nastro riscaldante a intervalli di 10 secondi fino a quando la temperatura delle siringhe raggiunge circa 51 gradi. Quando il termostato mostra una temperatura appropriata, fare clic su Esegui tutto nel software di controllo della pompa per eseguire le pompe delle siringhe e verificare che il flusso di fluido sia privo di bolle d'aria e di eventuali perdite.
Raccogliere i campioni di liposoma in una fiala e mettere in pausa o interrompere l'infusione quando entrambe le siringhe sono quasi vuote. Ricottura le soluzioni liposomiche raccolte in un bagno d'acqua di 60 gradi Celsius per 1-1/2 ore prima di trasferire le soluzioni ai tubi di dialisi per la dialisi contro un litro di solfato di ammonio millimolare per almeno quattro ore a 37 gradi Celsius. Quindi conservare i liposomi purificati a quattro gradi Celsius.
Per il caricamento remoto dei liposomi mediante gradiente di pH transmembrana, caricare 25 millilitri di HBS sulla parte superiore di una colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni e consentire a tutto l'eluente di fluire attraverso la colonna. Caricare un millilitro di liposomi dializzati sulla colonna. Quando tutta la soluzione lipidica è passata attraverso la colonna, aggiungere 1,5 millilitri di HBS fresco alla colonna.
Quando tutto il buffer è passato attraverso la colonna, aggiungere tre millilitri di HBS fresco alla colonna e raccogliere l'eluente. Quindi, aggiungere la soluzione DOX a un rapporto molare DOX:20 DOX:fosfolipidico a un millilitro di soluzione liposoma di scambio tampone in una fiala Biju e posizionare il flaconcino in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 1-1/2 ore. Dopo il caricamento, purificare i liposomi per cromatografia ad esclusione di dimensioni come appena dimostrato.
Per il rilascio del grilletto indotto dal riscaldamento laser del contenuto di liposoma, impostare il bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Quando la temperatura si è stabilizzata, aggiungere 200 microlitri di liposomi caricati da DOX ad ogni pozzo di una piastra chiara da 96 po 'e posizionare la piastra nel bagno d'acqua con il fondo immerso nell'acqua. Quindi impostare la corrente del sistema laser su 2,27 ampere e posizionare il collimatore del sistema laser cinque centimetri verticalmente sopra la superficie della piastra a 96 pozzi.
Accendere il laser e utilizzare una sonda di temperatura in fibra ottica per monitorare la temperatura una volta al minuto. A cinque e 10 minuti, aspirare 10 microlitri di liposomi caricati da DOX da ogni pozzo della piastra chiara da 96 po 'e aggiungere 190 microlitri di HBS a tre singoli pozzi di una piastra nera da 96 porri. Per valutare il rilascio completo del farmaco, mescolare 10 microlitri dei liposomi con 170 microlitri di HBS e 20 microlitri di soluzione detergente 1%Triton X-100 in tre singoli pozzi della piastra nera da 96 pompoli.
Quindi misurare l'intensità di fluorescenza DOX su un lettore di piastre. La produzione microfluidica di LTSL4 si traduce in una soluzione viscosa simile a un gel illustrata dal gran numero di bolle d'aria intrappolate mentre la preparazione di LTSL10 si traduce nella formazione di un liquido chiaro non viscoso. La misurazione dinamica dello scattering della luce di LTSL10 preparata a 51 gradi Celsius dimostra il diametro e la dispersione medi della Z previsti che indicano il successo dell'esperimento.
Quando l'LTSL10 viene preparato a 20 gradi Celsius, tuttavia, si ottengono liposomi più grandi e dispersi con conseguente prodotto non ottimale. Gli LTSL preparati con il metodo convenzionale di idratazione della pellicola lipidica con estrusione dimostrano un'efficienza di incapsulamento DOX del 50-80%Con ricottura, LTSL10 preparato da microfluidica si traduce in un significativo aumento dell'efficienza di incapsulamento DOX a una media dell'85% che indica il successo del caricamento remoto di DOX e la presenza del gradiente di pH transmembrana. Il profilo di rilascio DOX di LTSL10 è stato determinato come sensibile alla temperatura.
LTSL10 ha una transizione di fase relativamente ampia con esordio a 41,6 gradi Celsius che raggiunge picchi a 42,6 gradi Celsius. L'efficienza del carico ICG dipende dalla concentrazione iniziale di ICG e dalle dimensioni e dalla dispersione dei campioni. Inoltre, l'irradiazione ICG LTSL10 con un laser vicino all'infrarosso induce il riscaldamento fototermico innescando il rilascio di DOX.
Quando si tenta questa procedura, è importante garantire un flusso di fluido stabile in modo tale che la miscelazione del fluido e quindi la formazione di liposomi rimangano riproducibili. La ricottura e la dialisi liposoma sono due passaggi importanti per garantire una formulazione liposoma stabile con elevata capacità di carico. I test in vivo possono anche essere eseguiti per valutare la bio-distribuzione LTSL10, il rilascio di farmaci e l'attività antitumorale.
Il nostro protocollo può essere utilizzato per la produzione microfluidica di successo di liposomi termosensibili contenenti lisolipidi senza colesterolo per applicazioni di somministrazione di farmaci.
