Neovascolarizzazione, la generazione di nuovi vasi sanguigni è un processo altamente regolamentato sia in eventi normali che patologici. Per comprendere meglio la neovascolarizzazione, è importante ricostruire il processo in microambiente cellulare naturale in vitro. Abbiamo sviluppato un chip microfluidico e un controllo automatico.
Circolazioni altamente efficienti vengono fatte per formare micro-tubi perfusione e simulare di utilizzare la proteina per ricapitolare all'evento iniziale di nuova vascolarizzazione. Il chip di germinazione microfluidico era costituito da tre canali. Un canale di coltura cellulare endoteliale e un canale liquido erano separati da un ampio canale centrale di idrogel.
Il sistema di controllo microfluidico era costituito da una pompa a microsiringa e da una valvola di pizzico elettromagnetica. Un chip a trappola a bolle, un chip di germinazione microfluidico, una pompa micro-peristaltica e un serbatoio di mezzo di coltura. Con un sistema microfluidico, le cellule endoteliali potrebbero essere stimolate da un elevato stress da taglio luminare, da un livello fisiologico di flusso transendoteliale e da varie distribuzioni vascolari del fattore di crescita endoteliale contemporaneamente.
Pipetta 20 microliter di 125 microgrammi per millilitro di fibronectina in un'unica porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare. Tagliare una punta di pipetta per adattarsi alla porta del canale di coltura cellulare con le forbici. Inserire la punta della pipetta nell'altra porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare.
Quindi, pipettare l'aria dal canale di coltura cellulare per riempirla di fibronectina. Incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per un'ora. Prima della semina cellulare, pipettare 20 microliter di mezzo cellulare endoteliale in ogni porta di iniezione del mezzo e incubare i trucioli a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, pipettare tutti i supporti in tutte le porte di iniezione dei supporti. Successivamente, pipettare cinque microliter di sospensione cellulare in un'unica porta di iniezione multimediale del canale di coltura cellulare. Quindi, le cellule endoteliali si diffondono rapidamente su tutto il canale sotto pressione idrostatica differenziale.
Aggiungere circa quattro o sei microlitri di supporti ECM all'altra porta per regolare la pressione idrostatica e fermare lo spostamento della cella. Remote i trucioli all'incubatore di celle. Quindi, girare i trucioli ogni 30 minuti fino a quando le cellule endoteliali non si rovano intorno alla superficie interna del canale di coltura cellulare, due ore dopo.
Utilizzare la punta della pipetta per rimuovere le celle attaccate nelle porte di iniezione con molta attenzione. Quindi, inserire quattro adattatori Luer femmina spinati nelle porte di iniezione dei supporti e riempire con supporti ECM. Rimuovere i chip nell'incubatore di celle, cambiare i supporti ECM e gli adattatori Luer ogni 12 ore.
Per assemblare il sistema di controllo microfluidico, preparare due tubi in politetrafluoroetilene, due tubi corti in silicone, tre lunghi tubi in silicone, un adattatore Luer femmina spinato, un connettore di tipo Y e quindi tre connettori di tipo L. Riempire la siringa con 10 millilitri di mezzo ECM preriscaldato. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene alla siringa da un adattatore Luer femmina spinato.
Quindi, collegare l'altra estremità del tubo di politetrafluoroetilene a un connettore di tipo Y. Successivamente, collegare due lunghi tubi in silicone alle altre due estremità del connettore di tipo Y. Usiamo un tubo per connetterci al serbatoio e all'altro tubo per connetterci al chip trappola a bolle.
Collegare un altro lungo tubo di silicone al serbatoio. Successivamente, utilizzare due tubi brevi in silicone per collegare tutti i fori di ingresso e uscita sullo strato superiore del chip a trappola a bolle. Collegare un tubo di politetrafluoroetilene al back-end del chip.
Quindi, fissare una siringa sulla pompa a microsiringa. Agganciare due lunghi tubi in silicone alla valvola elettromagnetica di avvicinamento delle dita. Quindi, cambiare la valvola di avvicinamento elettromagnetica per aprire la tubazione tra la siringa e il serbatoio.
Iniettare mezzi al serbatoio utilizzando la pompa microsiringa per esaurire l'aria nel tubo. Quindi, cambiare di nuovo la valvola per aprire la tubazione tra la siringa e il chip trappola per bolle. Iniettare i supporti per riempire la camera liquida e il tubo di back-end del chip bubble trap.
Estraere i trucioli endoteliali dall'incubatrice cellulare, quindi rimuovere gli adattatori Luer sul lato della coltura cellulare. Inserire due tappi di tubo nelle porte di iniezione dell'idrogel del chip di germinazione microfluidico. Collegare il tubo back-end del chip bubble trap a una porta del canale di coltura cellulare.
Inserire un connettore di tipo T all'altra porta e collegarlo a un lungo tubo di silicio collegato al serbatoio. Agganciare il lungo tubo di silicone alla pompa micro peristaltica. Quindi, inserire un filtro dell'aria nel serbatoio.
Quindi, assemblare il chip di germinazione microfluidico nell'incubatore superiore del palco. Quindi, collegare la pompa del vuoto ai fori nello strato inferiore del chip a bolle da un tubo TPU. Impostare il volume di circolazione opposto e una portata nel programma personalizzato che controlla contemporaneamente la pompa a microsiringa e la valvola di avvicinamento delle dita elettromagnetica.
Impostare quindi la portata della pompa micro peristaltica. Accendere la pompa a microsiringa. Quindi, viene stabilito il sistema di controllo della circolazione.
Testiamo la funzione barriera di alcuni micro-vasi nel nostro modello misurando il coefficiente di permeabilità diffusionale di 40 kDa F-I-T-C destrina. Come mostrato nella figura, il coefficiente di permeabilità diffusione del chip di coltura statica con rivestimento cellulare è 0,1 più o meno 0,3 micrometri al secondo. E il coefficiente di permeabilità alla diffusione del canale vuoto senza rivestimento cellulare è di 5,4 più o meno 0,7 micrometri al secondo.
Il saggio di germinazione endoteliale ha mostrato che le cellule endoteliali germogliate nell'idrogel centrale in gran parte dopo 24 ore di lavorazione statica, mentre il grado di germogliatura è diminuito significativamente con l'aumento della sollecitazione di taglio luminare. Quantitativamente, la sollecitazione di taglio luminare ha diminuito significativamente la germinazione endoteliale in termini di area di germogliatura, lunghezza media di germogliatura e lunghezza del germoglio più lunga. Con il nostro sistema, lo stress da taglio sulle cellule endoteliali potrebbe essere facoltativamente cambiato in qualsiasi momento durante l'esperimento mentre il flusso transendoteliale è rimasto a livello fisiologico.
Questo modello biomimetico 3D in vitro può essere applicato direttamente allo studio del meccanismo di neovascolarizzazione e mantiene la potenziale promessa come piattaforma a basso costo per lo screening farmacologico e le applicazioni tossicologiche.
