Mikroakışkanlar, ölçülebilir nanopartikül boyutunda lipozomları hazırlamak ve büyük tekrarlanabilirlik ve ölçeklenebilirlik ile ortaya çıkan bir tekniktir. Bu protokol, doksorubisin gibi bir kemoterapötik ilaç ve indosiyanyeşil gibi floresan boya ile birlikte yüklemek için düşük ısıya duyarlı lipozomların çıkış yoluyla sürekli yüksek sağlar. Hücre hazırlığı öncelikle lipid film hidrasyon ve ekstrüzyon gibi yukarıdan aşağıya yaklaşım kullanın.
Klinik uygulamalar için büyük ve tekrarlanabilir gruplar hazırlamak zor olmaya devam etmektedir. Mikroakışkanların en büyük avantajı, sürekli ve otomatik bir şekilde çalışırken uzay ve zamanda yüksek kontrol edilebilirlik ile küçük sıvı hacmini idare edebilme yeteneğidir. Calvin Cheung'la prosedürü gösteren guanglong Ma ve Amalia Ruiz olacak.
Şırınga pompalarını monte etmek için, ikincil şırınga pompasının bilgisayar portunu ana şırınga pompasının ağ noktasına bağlamak için pompadan pompaya ağ kablosunu kullanın. Ana pompanın bilgisayar bağlantı noktasını bilgisayarın RS-232 seri portuna bağlamak için ağ kablosunu pompalamak için bilgisayarı kullanın. Staggard herringbone micromixer microfluidic cihaz monte etmek için, cihazın giriş ve çıkışları her tüp bağlamak için bir somun ve ferrule kullanın.
Sonra ikinci bir somun ve ferrule ve bir sendika montaj bir kadın luer her iki giriş için tüp terminali dönüştürmek için kullanın. Pompa kontrol yazılımını kurmak için, ana şırınga pompasının adresini ve ikincil şırınga pompasını sırasıyla Ad:01 ve Ad:02'ye atamak için şırınga pompasının kurulum düğmesini kullanın ve ardından bilgisayardaki pompa kontrol yazılımını açın. İki şırınga pompası otomatik olarak tespit edilmeli ve ardından bir bip sesi alınmalıdır.
Seçili HSW Norm-Ject 5cc çapı 12,45'e eşittir ve çapı 12,45 milimetreye atamak için. Pompa iki pompa için dakikada bir ve 0,75 mililitre için dakikada 0,25 mililitre oranı ayarlayın. Sesi beş mililitrenin üzerindeki herhangi bir değere ayarlayın ve her iki pompa için infüzyon modunu seçin.
Ardından ayarları onaylamak için ayarla'yı tıklatın. LTSL10 veya LTSL10 ICG lipid karışımı hazırlamak için, bir mililitre likit luer kilit şırıngasını kullanarak bir mililitre lipid karışımını ve diğer beş mililitrelik luer kilidi şırıngasını en az üç mililitre amonyum sülfat çözeltisini geri çekin. Yüklü şırıngaları dik pozisyondaki şırınga pompalarına yerleştirmek için şırınganın namlu flanşını pompanın tutucusuna kaydırın ve şırınganın dalgıç flanşını pompanın itici bloğuna takın ve ısıtma bandının diğer ucunu ve sıcaklık probunu yağ çözeltisini içeren termostatın etrafında termostatla sarın.
Isıtma bandının ucunu sulu solüsyonu içeren şırıngaya sarın, lipid karışımını içeren şırıngayı etanol girişine bağlayın ve amonyum sülfat çözeltisini içeren şırıngayı sulu girişe bağlayın. Gerektiğinde şırıngalardan hava kabarcıklarını çıkarmak için pistin konumunu ayarlayın ve şırıngaların sıcaklığı yaklaşık 51 dereceye ulaşana kadar ısıtma bandını 10 saniye aralıklarla takın ve çıkarın. Termostat uygun bir sıcaklık gösterdiğinde, şırınga pompalarını çalıştırmak ve sıvı akışının hava kabarcıkları ve herhangi bir sızıntı dan arınmış olup olmadığını kontrol etmek için pompa kontrol yazılımının tamamını tıklatın.
Lipozom örneklerini bir şişeye toplayın ve şırınga neredeyse boşolduğunda infüzyonu duraklatın veya durdurun. Anneal 60 derece santigrat su banyosunda toplanan lipozom solüsyon1-1/2 saat diyaliz tüpleri için diyaliz tüpleri için bir litre karşı 240 milimolar amonyum sülfat karşı en az dört saat 37 santigrat derece için çözümler aktarmadan önce toplanan lipozom çözeltileri. Sonra saflaştırılmış lipozomları 4 santigrat derecede saklayın.
Lipozomların transmembran pH gradyanı ile uzaktan yüklenmesi için, 25 mililitre HBS'yi bir boyut dışlama kromatografi sonuna yükleyin ve tüm eluentin sütundan akmasını bekleyin. Sütuna bir mililitre diyalizli lipozom yükleyin. Tüm lipid çözeltisi sütundan geçtiğinde, sütuna 1,5 mililitre taze HBS ekleyin.
Arabellek sütunun içinden geçtiğinde, sütuna üç mililitre taze HBS ekleyin ve eluent'i toplayın. Daha sonra, 1:20 DOX:fosfolipid molar oranı bir Mililitre tampon değişimi lipozom çözeltisi bir Biju şişesinde dox çözeltisi ekleyin ve 1-1/2 saat boyunca 37 derece santigrat su banyosunda şişe yerleştirin. Yüklendikten sonra lipozomları az önce gösterildiği gibi boyut dışlama kromatografisi ile arındırın.
Lazer ısıtma lipozom içeriğinin tetikleme salmak için, 37 santigrat derece su banyosu ayarlayın. Sıcaklık stabilize olduğunda, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 200 mikrolitre DOX yüklü lipozom ekleyin ve tabağı su banyosuna yerleştirin ve alt kısmı suya batırılır. Daha sonra lazer sistemi akımını 2,27 amper olarak ayarlayın ve lazer sistemi kolimatör'ü 96 kuyulu plakanın yüzeyinin beş santimetre yukarısına dikey olarak yerleştirin.
Lazeri açın ve sıcaklığı dakikada bir kez izlemek için fiber optik sıcaklık probu kullanın. Beş ve 10 dakika, dox 10 mikrolitre net 96-iyi plaka her kuyudan lipozomlar yüklü aspire ve siyah 96-iyi plaka üç ayrı kuyulara HBS 190 mikrolitre ekleyin. Tam ilaç salınımını değerlendirmek için, 10 mikrolitre lipozom ile 170 mikrolitre HBS ve 20 mikrolitre %1 Triton X-100 deterjan çözeltisini siyah 96 kuyulu plakanın üç ayrı kuyularında karıştırın.
Daha sonra bir plaka okuyucu üzerinde DOX floresan yoğunluğunu ölçün. LTSL4'ün mikroakışkan üretimi, çok sayıda sıkışmış hava kabarcığı yla gösterilen jel benzeri viskoz bir solüsyon la sonuçlanırken LTSL10'un hazırlanması açık, viskoz olmayan bir sıvının oluşmasına neden olabilir. LTSL10'un 51 santigrat derecede hazırlanan dinamik ışık saçılma ölçümü, beklenen Z ortalaması çapını ve dağılımını gösterir ve deneyin başarısını gösterir.
LTSL10 20 santigrat derecede hazırlandığında, daha büyük ve daha dağınık lipozomlar elde edilir ve bu da optimal olmayan bir ürünle sonuçlanır. Konvansiyonel lipid film hidrasyon yöntemi ile ekstrüzyon ile hazırlanan LTSL'ler, mikroakışkanlar tarafından hazırlanan LTSL10 ile DOX kapsülleme veriminde önemli bir artış ile DOX kapsülleme veriminin ortalama %85 oranında artarak DOX'un uzaktan yüklenmesinin başarısını ve transmembran pH gradyanının varlığını gösteren bir DOX kapsülleme verimini göstermektedir. LTSL10'un DOX salınım profilinin ısıya duyarlı olduğu belirlenmiştir.
LTSL10 41.6 santigrat derece de başlangıcı ile nispeten geniş faz geçiş vardır 42.6 santigrat derece zirveleri. ICG yüklemesinin verimliliği ilk ICG konsantrasyonuna ve numunelerin büyüklüğüne ve dağılımına bağlıdır. Ayrıca, yakın kızılötesi lazer ile LTSL10 ICG ışınlama DOX serbest bırakılması tetikleyen fototermal ısıtma indükler.
Bu prosedürü denerken, sıvının karıştırılması ve bu nedenle lipozomların oluşumunun tekrarlanabilir kalması gibi kararlı bir akışkan akışı sağlamak önemlidir. Lipozom annealing ve diyaliz yüksek yükleme kapasitesi ile istikrarlı bir lipozom formülasyonu sağlamak için iki önemli adımdır. In vivo test de LTSL10 biyo-dağıtım değerlendirmek için yapılabilir, ilaç salınımı, ve antikanser aktivitesi.
Protokolümüz, ilaç dağıtım uygulamaları için kolesterol içermeyen lizozlipid içeren termoduyarlı lipozomların başarılı mikroakışkan üretimi için kullanılabilir.
