Esperimenti di microscopia time-lapse sono stati eseguiti presso biomolecolari Screening Facility (BSF), EPFL. Ringraziamo Marc Delachaux (servizio Audiovisuel, EPFL) per la videografia e montaggio del film.

Nota: In questo studio, è stata utilizzata la linea cellulare E14 ES. Tuttavia, questo protocollo è direttamente applicabile a qualsiasi altra linea di mouse ES cellula che esprime una proteina di interesse fusa a un tag di SNAP, codifica la proteina endogena oppure mediante sovraespressione. Per gli esempi riportati nella sezione risultati, linee cellulari di doxiciclina-inducible SNAP-tag fusione sono stati usati (SNAP-tag fusa per le seguenti proteine: Nanog, Oct4, Srsf11, o per le proteine fluorescenti mOrange2 e sfGFP e messo sotto il controllo di un doxiciclina-inducible promotore. Vedi11 per ulteriori informazioni sui plasmidi utilizzati per la generazione di doxiciclina-inducible linee cellulari fusione SNAP-tag). Il sistema doxiciclina-viscoelastico può essere particolarmente utile, in quanto consente di controllare strettamente la tempistica e l'intensità dell'espressione della proteina di interesse. C-terminale di posizionamento del tag SNAP è consigliato, come cambiare il N-terminale sequenza dell'amminoacido è più probabile che altera l'emivita della proteina (N-fine regola12).
1. E-caderina rivestimento e semina delle cellule
<ol><li>Generare una linea di cellule ES che esprime una proteina di interesse fusa per il SNAP-tag4.</li>
	<li>Cappotto 100 mm piastre di coltura cellulare con 4 mL di 0,1% di gelatina (diluito in tampone fosfato salino (PBS) senza Ca2 +/Mg2 +) per 1 h. rimuovere gelatina e lasciare asciugare per 1 h. uso immediatamente o conservare i piatti rivestiti per fino a 2 mesi.</li>
	<li>Crescere la linea cellulare di interesse nel mezzo di coltura cellulare ES (Glasgow minimo essenziale Medium, supplementato con 10% ES cella-qualificato siero bovino fetale, piruvato di sodio di 2 mM, gli aminoacidi non essenziali di 1%, 1% di penicillina/streptomicina, 2mm L-glutamina, 100 µM 2- mercaptoetanolo, fattore inibitorio di leucemia (LIF), 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352) rivestite con gelatina piatti a 37 ° C e 5% di CO2 per 2 giorni fino a raggiungere una confluenza delle cellule Mio 10-20 per ogni piatto. Nota: Qui, LIF è stato prodotto da transitori di transfezione delle cellule HEK 293T, seguita da surnatante raccolta e filtraggio. Ogni lotto di LIF è stato testato per il suo potenziale mantenere la pluripotenza, ma non sono state determinate concentrazioni. Tuttavia, ricombinante LIF è anche disponibile in commercio e la concentrazione comunemente usata per la coltura delle cellule di topo ES è 1000 unità/mL13.</li>
	<li>Ricoprire una piastra a 96 pozzetti adatta per imaging con 30 µ l di mouse recombinant della proteina chimera di E-caderina Fc (E-cad-Fc) per pozzetto (5 ng / µ l, diluito in PBS con Ca2 +/Mg2 +. Utilizzare concentrazioni stock di 100 ng / µ l, conservato a-80 ° C). Evitare di pipettaggio estesa, come E-cad-Fc è molto fragile. Incubare a 37 ° C per 1,5 ore. Nota: A seconda del microscopio, altri formati potrebbero essere utilizzati.</li>
	<li>Aspirare E-cad-Fc, lavare una volta con 100 µ l di PBS con Ca2 +/Mg2 +e aggiungere 100 µ l di terreno di coltura delle cellule ES pre-riscaldato.</li>
	<li>Lavare le cellule di interesse con 5 mL di PBS senza Ca2 +/Mg2 +. Aspirare e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,25%. Incubare per 4 min a 37 ° C. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura delle cellule di ES, risospendere e spin giù a 1000 x g per 4 min. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 2 mL di terreno di coltura di cellule ES nuovo. Nota: PBS senza Ca2 +/Mg2 + dovrebbe essere usato per lavare le cellule prima di trypsinization al fine di rimuovere ioni Ca2 + , che sono necessari per l'adesione delle cellule. Al contrario, per la diluizione E-cad-Fc e rivestimento (punto 1.4), è possibile utilizzare PBS con Ca2 +/Mg2 +, poiché l'adesione delle cellule di ES per E-cad-Fc piatti rivestiti è Ca2 +-dipendente14.</li>
	<li>Diluire il sedimento celle 01:10 in 1 mL di terreno di coltura delle cellule di ES e conta, utilizzando una camera di conteggio (carico 10 µ l per una camera di 0,1 mm di profondità).</li>
	<li>Seme 30.000 cellule/cm2 a E-cad-Fc rivestite in lamiera di imaging. Riempire fino a 200 µ l per pozzetto con mezzo di coltura cellulare ES. Per linee cellulari doxiciclina-inducibile, indurre con una dose adeguata di doxiciclina (ottimizzare la dose e la tempistica dell'induzione in anticipo. Le linee cellulari utilizzate qui sono state trattate con doxiciclina di 500 ng/mL 24 h prima di imaging). Incubare a 37 ° C e 5% CO2 e procedere con l'impulso di etichettatura e di imaging 24 h dopo la semina delle cellule.</li>
</ol>2. etichettatura del SNAP-tag di impulso
Nota: Per gli esperimenti di decadimento di proteina è fondamentale utilizzare un'adeguata concentrazione di tintura SNAP. La concentrazione deve essere sufficientemente elevata per produrre un segnale luminoso all'inizio di time-lapse, come la fluorescenza si riduce nel tempo. Tuttavia, utilizzando concentrazioni di tintura troppo elevato potrebbe causare tintura residua lasciata nel terreno o nelle cellule anche dopo il lavaggio. Il colorante libero potrebbe associare successivamente recentemente prodotti SNAP-tag molecole nel corso del film, che distorcono la curva di decadimento. Il segnale di fluorescenza osservata dipenderanno le proprietà della tintura, la linea cellulare utilizzata, nonché il livello di espressione della proteina corrispondente. Di conseguenza, è fondamentale ottimizzare la concentrazione di colorante testando diluizioni diverse, a partire dalla diluizione suggerita per l'imaging cellulare diretta dal produttore. Per questo studio, è stato utilizzato un substrato fluorescente da'. Una concentrazione ottimale di 12 nM è stato determinato per linee cellulari sovraespressione doxiciclina-inducibile.
<ol><li>Diluire la tintura SNAP alla concentrazione appropriata nel terreno di coltura delle cellule ES pre-riscaldato. Usare una pipetta per rimuovere delicatamente il mezzo dalle cellule precedentemente seminate nella piastra 96 pozzetti e aggiungere 50 µ l di colorante diluito di SNAP per pozzetto. Incubare per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Il colorante diluito con una pipetta di aspirare e lavare 3 volte con 200 µ l di PBS preriscaldata (senza Ca2 +/Mg2 +). Aggiungere 200 µ l di terreno di coltura delle cellule di ES ed incubare per 15 min a 37 ° C.</li>
	<li>Ripetere i passaggi precedenti di lavaggio due volte di più. Nota: Vasto lavaggio è importante al fine di rimuovere qualsiasi colorante non associato. I passaggi ripetuti lavaggi con PBS rimuovere il residuo dalla tintura extracellulare nel mezzo, considerando che le incubazioni di 15 min garantiscono etichettatura robusto delle proteine di fusione SNAP-tag prima di iniziare l'esperimento di formazione immagine. Tuttavia, eseguire la procedura di lavaggio pipettando delicato e non utilizzare un aspiratore automatico, in quanto le cellule seminate su E-cad-Fc tendono a staccarsi facilmente.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di medie di imaging. Per ridurre la fluorescenza di fondo, usare il mezzo libero rosso fenolo (supplementato con 10% ES cella-qualificato siero bovino fetale, piruvato di sodio di 2 mM, gli aminoacidi non essenziali di 1%, 1% di penicillina/streptomicina, 2mm L-glutamina, 100 µM 2-mercaptoetanolo, LIF, 3 µM CHIR99021 e 0,8 µM PD184352).</li>
</ol>3. Time-lapse microscopia
<ol><li>Utilizzare un microscopio per formazione immagine live, che permette di CO2e temperatura controllata. Impostare la temperatura a 37 ° C e la CO2 al 5% prima dell'uso e permettono di equilibrare per 1-2 h.</li>
	<li>Inserire la piastra al microscopio e trovare i punti adatti per l'imaging. Selezionare i punti dove le cellule sono distribuite uniformemente, ma non troppo densa, come questo faciliterà l'analisi. Regolare il numero di punti selezionati per il numero di cellule necessarie per l'analisi. In questo studio, sono state registrate 3-5 punti per ogni linea cellulare.</li>
	<li>Selezionare l'obiettivo. Un obiettivo X 20 è adatto per le dimensioni delle cellule di ES.</li>
	<li>Selezionare le impostazioni di illuminazione per i canali fluorescente per essere registrato. Regolare la potenza del laser e l'esposizione secondo l'intensità del segnale di fluorescenza da celle di interesse. Assicurati di ottenere un forte segnale iniziale, poiché sarà diminuire nel corso del film, ma evitare laser poteri superiori al 30% al fine di ridurre al minimo la fototossicità e photobleaching. Per questo studio, un filtro di eccitazione di 632/22 nm (lunghezza d'onda/passa-banda), filtro di emissione di 679/34 nm (lunghezza d'onda/passa-banda), potere del laser di 10% e tempo di esposizione di 100 ms sono stati usati.</li>
	<li>Selezionare gli intervalli di imaging e la durata dell'esperimento time-lapse. Per le proteine con emivite previste di 2-20 h, scegliere tempi di acquisizione di 12-24 h con intervalli di tempo di 15 min. Per le proteine studiano, ridurre gli intervalli e tempi di acquisizione, per aumento di proteine più longevo di conseguenza.</li>
	<li>Avviare imaging.</li>
</ol>4. elaborazione ed analisi di immagini
<ol><li>Raccogliere le immagini acquisite come una pila in formato tiff. Per l'ulteriore elaborazione e analisi, utilizzare il software di FIJI15. Se i dati di time-lapse non viene raccolta come una pila dal software microscopio, aprire tutti i fotogrammi dell'esperimento time-lapse del software (sia facendo clic su File | Apri... o trascinare e far cadere i file corrispondenti sulla barra degli strumenti) e fare clic su immagine | Stacks | Immagini di Stack.</li>
	<li>Utilizzare la funzione di sfondo Sottrai per rimuovere lo sfondo da tutte le foto nello stack. A tale scopo, fare clic su processo | Sottrarre il Background. Selezionare il raggio di rotolamento sfere nella finestra a comparsa. Utilizzare un raggio che è almeno la dimensione delle celle imaged. Per applicare la sottrazione di sfondo a tutte le celle dello stack, selezionare Sì nella stack processo? finestra pop-up.</li>
	<li>Selezionare una cella di interesse e disegnare un'area di interesse (ROI) intorno ad esso utilizzando la barra degli strumenti. Per segnali nucleari, è possibile utilizzare la selezione ovale primo facendo clic sulla scheda corrispondente nella barra degli strumenti e quindi facendo clic sul nucleo di interesse e modificando l'ovale intorno ad esso. Per segnali citoplasmatici o regioni molto dense utilizzare la selezione a mano libera per essere in grado di seguire da vicino i contorni delle cellule. Evitare di includere troppo ampie regioni dello sfondo, anche se non è necessario seguire i contorni delle cellule proprio a causa di successiva sottrazione di tutti i pixel dello sfondo (passo 4.8-4.9).</li>
	<li>Aggiungere la regione di interesse per il manager di ROI facendo Analyze | Strumenti | Manager di ROI | Aggiungi, o premendo T sulla tastiera.</li>
	<li>Procedere alla cornice successiva spostando la scheda nella finestra stack o premendo MAIUSC + < sulla tastiera, quindi ripetere le operazioni precedenti. Seguire la cella di interesse durante tutto il corso del film e aggiungere il ROI di ogni fotogramma al manager di ROI. Salvare il ROI finale impostata per ogni cella cingolato cliccando più | Salvare... nel manager di ROI. Nota: Dopo le divisioni delle cellule, monitorare separatamente due cellule della figlia e sommare le relative intensità integrate dopo la sottrazione di sfondo (vedere i passaggi 4.6-4.9) per tenere conto per la diluizione della proteina durante la divisione cellulare. Salvare i set di ROI per due cellule della figlia.</li>
	<li>Una volta che la cella di interesse viene tenuta traccia per tutto il film, fare clic su misura, per ottenere i valori di intensità media e l'area della ROIs. Copiare i valori ottenuti in un programma di foglio elettronico e calcolare l'intensità integrato prima della cella per ogni punto di tempo come segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> dove direcè l'intensità media ezonaCla zona del ROI corrispondente.</li>
	<li>Per stimare lo sfondo locale, aggiungere un ROI vicino alla cella di interesse per ogni intervallo di tempo. Evitare di includere qualsiasi segnale di fluorescenza cellulare. Utilizzare un ROI circolare che ha circa le dimensioni di una cella e spostare o ridurre di conseguenza se necessario, ad esempio se le cellule vicine interferiscano. Procedere come descritto in precedenza con il cellulare impostato al fine di ottenere uno sfondo ROI ROI impostare e copiare i valori di intensità misurata al foglio di calcolo.</li>
	<li>Per ottenere un valore corretto di sfondo per l'intensità integrata della cella, prima di calcolare l'intensità integrata dello sfondo per ogni punto di tempo: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> dove direBG è l'intensità media del segnale di fondo e AreaC è l'area del ROI che circondano la cella. Non utilizzare l'area dello sfondo ROI, a meno che entrambe le aree hanno la stessa dimensione.</li>
	<li>Calcolare l'intensità integrata sottratto sfondo finale della cella per ogni punto di tempo: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>Per normalizzare le curve di decadimento di singola cellula, dividere il valore di intensità di ogni tempo-punto per il valore di intensità del primo punto di tempo. Nota: L'adattamento della curva (vedere il punto 4.11) possa essere eseguito su ogni singola cella o sulla media della popolazione. Una normalizzazione è richiesta se viene calcolata una media basati sulla popolazione al fine di evitare pregiudizi da intensità di fluorescenza diverse fra le cellule. La normalizzazione assicura quindi che ogni cella contribuisce con lo stesso peso alla curva di decadimento finale. Inoltre, la normalizzazione può essere utile per visualizzare i decadimenti di singola cellula indipendentemente dalla loro intensità di fluorescenza assoluta (Vedi Figure 3A-3C). Tuttavia, se solo la cella singola emivite sono determinate e i dati non sono una media, il passo di normalizzazione può essere omesso e l'adattamento delle curve può essere eseguita direttamente sui dati raw.</li>
	<li>Per la stima della emivita della proteina, è necessario utilizzare uno strumento di montaggio di curva. In questo studio, la curva MATLAB toolbox 3.4.1 di montaggio è stata utilizzata, che si trova per impostazione predefinita nella sezione applicazioni dell'interfaccia utente MATLAB. Importare l'intensità di fluorescenza e i valori di ora da foglio di calcolo elettronico in MATLAB facendo clic sulla scheda Importa dati aprire la curva di raccordo della casella degli strumenti e selezionare i punti di tempo e dati di decadimento fluorescenza nei dati X e Y di dati Tab. Scegli Custom equazione nel raccordo curva scheda e immettere l'equazione per un decadimento esponenziale: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> dove f (t) è l'intensità di fluorescenza in un dato punto di tempo, un l'intensità iniziale e b il tasso di decadimento. In Opzioni di adattamento..., selezionare 0 per il limite inferiore di un e b. I valori stimati per un e b apparirà nella finestra dei risultati. Calcolare il tempo di dimezzamento come segue: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Protein+Half-Lives.">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il passaggio più importante quando si utilizza un tag di SNAP per monitorare il decadimento della proteina è per garantire che nessun residuo colorante non legato è lasciato nel terreno o nelle cellule dopo il lavaggio, altrimenti si potrebbe associare a recentemente prodotte molecole SNAP-tag più tardi nel corso dell'esperimento e ther Eby compromesso la curva di decadimento. Questo è un lato ottenuta eseguendo attentamente tutti i passaggi di lavaggio descritta. D'altra parte, la concentrazione di colorante dovreb...

È noto che proteine cellulari subiscono ampio turnover, con tassi di sintesi e degradazione essendo specifico per ogni proteina e soggette a regolazione fisiologica. Tradizionalmente, tassi di degradazione delle proteine sono stati misurati utilizzando metodi di massa, quali l'analisi di chase impulso radioattivo, o che coinvolgono gli inibitori della sintesi di proteine quali cicloesimmide1. Più recentemente, isotopo stabile etichettatura con gli amminoacidi nella coltura delle cellule (SILAC) in combinazione con la spettrometria di massa è stato istituito per quantificare il turnover delle proteine su una scala globale2. Tuttavia, questi metodi sono limitati da una media di popolazione e informazioni sulla variabilità della cellula--cellula sono quindi persi. Inoltre, i cambiamenti transitori nella degradazione delle proteine che non sono sincronizzati in tutta la popolazione delle cellule non possono essere identificati.
In alternativa, emivite di proteina possono essere determinate anche da approcci basati sulla fluorescenza, che spesso hanno il vantaggio di fornire la risoluzione di singole cellule. Ad esempio, una proteina fluorescente verde fuse (paGFP) è stata utilizzata per determinare Oct4 emivita in embrione dei mammiferi primi3. Un altro metodo per monitorare il decadimento della proteina in cellule viventi è l'uso di un tag di SNAP in combinazione con Time-lapse imaging di fluorescenza. Il tag di SNAP è una versione mutante del DNA riparazione enzima O6- alchilguanina DNA-alchiltransferase (AGT) che reagisce specificamente con benzylguanine derivati (BG), che possono essere accoppiati a sonde molecolari4,5, 6. di conseguenza, qualsiasi proteina di fusione SNAP-tag può essere irreversibilmente etichettata con un colorante fluorescente, di permeabili delle cellule. Impulso di etichettatura di una proteina di interesse fusa per il SNAP-tag, seguito da interruzione della tintura residua, permette per il monitoraggio del degrado della popolazione proteina marcata e così per determinare il tempo di dimezzamento della proteina. SNAP-tag sono stati utilizzati con successo per impulso-insegua etichettatura delle proteine e per la determinazione della proteina emivite in aderente delle cellule di cultura ed in vivo5,7,8,9. Una grande varietà di substrati SNAP-tag che coprono comunemente usato fluorescente spectra è disponibili in commercio, consentendo la selezione della tintura ottima per ogni specifica applicazione. Così, SNAP-tag possono essere utilizzati anche per l'imaging multicolore in combinazione con altre proteine di fusione fluorescenti o coloranti. Cella-impermeabile coloranti sono adatti per l'etichettatura delle proteine di membrana-legato, mentre cellula-permeabile coloranti sono applicabili per il monitoraggio di proteine intracellulari e di membrana-limitano. Inoltre, alcune di queste sonde non presentano quasi nessuna fluorescenza basale e solo avviare l'emissione di un segnale fluorescente forte legandosi ad un SNAP-tag10.
Questo protocollo viene descritto come misurare i tassi di degradazione delle proteine differenti di interesse in singole cellule utilizzando un tag di SNAP. Qui abbiamo applicare questo metodo a cellule staminali embrionali (ES) topo coltivate su E-caderina, ma dovrebbe essere possibile usarlo con qualsiasi tipo di cellule in coltura aderente. Indichiamo che impulso etichettatura delle proteine di fusione SNAP-tag seguite da formazione immagine di fluorescenza time-lapse consente di determinare le emivite unicellulare di varie proteine di interesse e fornisce una stima della variabilità della cellula--cellula di emivite in un popolazione di cellule coltivate.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium&amp;nbsp; Non-Essential Amino Acids</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory factor</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS 10x concentrated</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS Without Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>Open-source image analysis software</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture

Le proteine sono in uno stato dinamico di sintesi e degradazione e la loro emivita può essere regolata in varie circostanze. Tuttavia, la maggior parte comunemente utilizzati approcci per determinare l'emivita della proteina o sono limitate a medie della popolazione dalla cellule lisate o richiedono l'uso di inibitori della sintesi di proteina. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la proteina emivite in singole cellule aderenti, con proteine di fusione SNAP-tag in combinazione con Time-lapse microscopia di fluorescenza. Qualsiasi proteina di interesse fusa ad un SNAP-tag possa legarsi covalentemente da una tintura di permeabili delle cellule fluorescente, che è accoppiata ad un derivato di benzylguanine, e il decadimento della popolazione proteina marcata può essere monitorato dopo interruzione della tintura residua. Successiva delle cellule di rilevamento e la quantificazione dell'intensità di fluorescenza integrata rispetto ai risultati di tempo in una curva di decadimento esponenziale per ogni cella cingolato, permettendo per determinare i tassi di degradazione delle proteine in cellule singole di adattamento della curva. Questo metodo fornisce una stima per l'eterogeneità delle emivite in una popolazione di cellule in coltura, che non può essere valutato facilmente con altri metodi. L'approccio qui presentato è applicabile a qualsiasi tipo di cellule aderenti coltivate che esprime una proteina di interesse fusa a un tag di SNAP. Qui usiamo cellule staminali embrionali (ES) topo coltivate su piastre per colture cellulari E-cadherin-rivestito per illustrare come singola cella degradazione tassi di proteine con una vasta gamma di dimezzamento possono essere determinati.

Il protocollo descritto fornisce una stima della variabilità cellula--cellula in Half-Life per qualsiasi data proteina fusa a un tag di SNAP. L'uso di ricombinanti E-cadherin-Fc per il rivestimento della piastra imaging consente risoluzione unicellulare in cellule ES, che altrimenti crescere nelle colonie. Cellule singole possono essere monitorate separatamente durante tutto il corso del film ( Figura 1A).
Al fine di determinare il tempo di dimezzamento di protei...

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Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Questo protocollo descrive un metodo per determinare la proteina emivite in singole cellule aderenti, utilizzando impulsi etichettatura e time-lapse imaging di fluorescenza di proteine di fusione SNAP-tag.

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.5K Views.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Questo protocollo descrive un metodo per determinare la proteina emivite in singole cellule aderenti, utilizzando impulsi etichettatura e time-lapse imaging di fluorescenza di proteine di fusione SNAP-tag.

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Biochimica

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Immunologia e infezioni

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Biologia

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Saggi per la degradazione delle proteine ​​nelle cellule mal ripiegate

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high throughput. In general, the acquisition of single-cell time courses from cultured cells is hampered by cell motility and diversity of cell shapes. Adhesive micro-arrays standardize single-cell conditions and facilitate image analysis. LISCA combines single-cell microarrays with scanning time-lapse microscopy and automated image processing. Here, we describe the experimental steps of taking single-cell fluorescence time courses in a LISCA format. We transfect cells adherent to a micropatterned array using mRNA encoding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) and monitor the eGFP expression kinetics of hundreds of cells in parallel via scanning time-lapse microscopy. The image data stacks are automatically processed by newly developed software that integrates fluorescence intensity over selected cell contours to generate single-cell fluorescence time courses. We demonstrate that eGFP expression time courses after mRNA transfection are well described by a simple kinetic translation model that reveals expression and degradation rates of mRNA. Further applications of LISCA for event time correlations of multiple markers in the context of signaling apoptosis are discussed.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays LISCA - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

We present a method for the acquisition of fluorescence reporter time courses from single cells using micropatterned arrays. The protocol describes the preparation of single-cell arrays, the setup and operation of live-cell scanning time-lapse microscopy and an open-source image analysis tool for automated preselection, visual control and tracking of cell-integrated fluorescence time courses per adhesion site.

Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Misurazione dei tassi di turnover proteico in cellule coltivate senescenti e non in divisione con etichettatura metabolica e spettrometria di massa

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

La quantificazione temporale di espressione MAPK indotta in cellule di lievito singole

Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione

Saggi per la degradazione delle proteine nelle cellule mal ripiegate

Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico

Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare

Cella singola quantificazione dei tassi di degradazione delle proteine mediante microscopia a fluorescenza time-lapse in coltura delle cellule aderenti

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Saggio di crescita a base Reporter, per l'analisi sistematica di proteine degradazione

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