Gli autori sono grati agli allevatori e alla società Boyé accouvage (La Boissière en Gâtine, Francia) per la fornitura di uova fecondate. Questo studio è stato condotto sotto l'egida del consorzio di ricerca APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019), finanziato dal Région Centre Val de Loire, Francia.

Le procedure di cura degli animali sono state eseguite conformemente alle linee guida stabilite dalla direttiva del Consiglio delle Comunità europee (86/609/CEE) e dai regolamenti francesi sulla sperimentazione animale.
1. Preparazione dell'isolatore
<ol><li>Inserire i materiali necessari in un isolatore rigido a pressione positiva: tubi da 50 ml, pipette di plastica da 5, 10 e 25 ml, alimentazione irradiata, acqua autoclavata e contenitori di plastica sigillati sterili.</li>
	<li>Riempire la trappola germicida di trasferimento con una soluzione di ammonio quaternario al 2%.</li>
	<li>Sterilizzare l'isolatore tre volte con vapore di formaldeide utilizzando 60 ml di formalina (24% formaldeide) aggiunti a 30 g di permanganato di potassio per metro cubo (m3). Spostare i materiali all'interno dell'isolatore tra una sterilizzazione e l'altra per garantire la sterilizzazione di tutte le superfici di contatto.</li>
	<li>Impostare la temperatura dell'isolatore a 37 °C per almeno 2 giorni prima di introdurre le uova. Impostare l'igrometro al 65-70% di umidità relativa (RH) il giorno dell'introduzione.</li>
</ol>2. Raccolta e incubazione delle uova
<ol><li>Raccogliere le uova provenienti da allevamenti selezionati sulla base di un buon tasso di schiusa delle galline ovaiole (almeno l'80% al picco della produzione di uova) e del loro buono stato sanitario (cioè assenza di comuni agenti patogeni del pollame e assenza di malattie all'interno del gregge). Seleziona visivamente uova pulite e impeccabili sul tapis roulant.</li>
	<li>Decontaminare immediatamente la superficie dell'uovo immergendole per 5 minuti in una soluzione di acido peracetico all'1,5% a temperatura ambiente.</li>
	<li>Trasportare le uova alla struttura sperimentale utilizzando una scatola decontaminata con vapore di formaldeide.</li>
	<li>Conservare le uova per 24 ore a 4 °C. Ripetere il processo di decontaminazione descritto nel passaggio 2.2 e metterli in un incubatore da cova (Giorno 0) per 19 giorni.</li>
</ol>3. Schiusa
<ol><li>Il giorno 19, verificare la fertilità, la vitalità (motilità) e lo sviluppo dell'embrione candificandoli usando un leggero candler di uova in condizioni sterili. Introdurre solo uova embrionate vive negli isolatori sterili da cova.</li>
	<li>Decontaminare le uova selezionate spruzzando una soluzione di acido peracetico all'1,5% per 30 s o fino a coprire l'intera superficie di ciascun uovo. Le uova rimarranno a contatto con lo spray per 16 minuti e 30 secondi durante il trasferimento in isolatori.</li>
	<li>Trasferire le uova negli isolatori sterili da cova e sciacquarle con acqua demineralizzata sterile prima di metterle nello spazio di schiusa. NOTA: Gli animali vengono schiusi e allevati in isolatori sterili. Sono alimentati ad libitum con una dieta commerciale sterilizzata mediante irradiazione gamma e annaffiati con acqua di rubinetto autoclavata fornita da distributori d'acqua.</li>
</ol>4. Analisi dello stato batteriologico
<ol><li>Un giorno dopo la schiusa, prelevare un campione fecale direttamente dal retto di diversi pulcini e raggrupparli in una provetta di vetro sterilizzata per rendere questo campione rappresentativo di tutti gli animali all'interno di un determinato isolatore.</li>
	<li>I campioni fecali essendo più o meno liquidi, aggiungere un equivalente di 1 mL di feci a 9 mL di brodo di tioglicolato con resazurina. Aggiungere il campione fecale rimanente a 9 ml di brodo per infusione cardiaca cerebrale (BHI) e incubare le provette a 37 °C senza agitare per 18-48 ore. Ciò consentirà la crescita di una vasta gamma di specie anaerobiche aerobiche, facoltative e non fastidious. NOTA: Il brodo di tioglicolato con resazurina è destinato alla rilevazione di batteri anaerobici nonfastidi ma consente anche il rilevamento di batteri aerobici. Questo mezzo è conforme alle farmacopee europee, americane e giapponesi per i test di sterilità 18,19,20.</li>
	<li>Osservare visivamente se si verificano modifiche nei mezzi di crescita dopo 18 ore di incubazione. Dopo 48 ore, prendere una goccia dal mezzo di brodo fecale BHI, posizionarla su un vetrino e osservare al microscopio (ingrandimento 40X) per l'assenza o la presenza di batteri.</li>
	<li>Se c'è un sospetto sulla presenza di batteri, prelevare un campione dalla coltura BHI e seminarlo su piastre di agar BHI. Incubare a 37 °C per 18-48 ore.</li>
	<li>Se sono presenti colonie, eseguire tecniche ad alto rendimento come la spettrometria di massa MALDI-TOF per una precisa identificazione microbica. NOTA: Dopo 72 h, se le analisi batteriologiche sono negative, gli animali sono dichiarati privi di germi.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Diversi metodi per generare polli privi di germi sono stati precedentemente descritti 7,21,22. Metodi semplici, come quello qui presentato, utilizzano diversi disinfettanti per ridurre la carica batterica nella superficie dell'uovo e negli isolatori. I disinfettanti più comunemente usati sono cloruro mercurico, ammonio quaternario, iodoformio, ipoclorito di sodio e soluzioni di biossido di cloro. I risultati sono spesso soddisfacenti. Tuttavia, nonostante l'accessibilità di questi metodi, poche strutture possono applicare il metodo e allevare gli animali su larga scala, rendendo così l'utilizzo di polli privi di germi un approccio relativamente raro, utilizzato solo per affrontare questioni scientifiche molto specifiche. I metodi, i materiali e le attrezzature qui descritti consentono una percentuale di schiusa altamente efficiente di polli da carne privi di germi, che rimangono sani e sterili per almeno 3 settimane (la durata degli esperimenti scientifici a cui sono stati prodotti).
I risultati mostrano che l'adattamento del protocollo alla produzione di pulcini privi di germi da uova raccolte in allevamenti di pollame commerciali ha successo. L'esperienza con la produzione di uova SPF rivela che l'efficienza della schiusa dipende principalmente dall'età delle galline ovaiole e dalla qualità delle uova raccolte. Entrambi i parametri sono stati presi in considerazione quando sono stati scelti gli allevamenti e le uova raccolte. Utilizzando lo stesso metodo, il tasso medio di schiusa dei polli da carne privi di germi è molto migliore di quello ottenuto nell'ultima produzione di galline ovaiole SPF presso il nostro stabilimento (79% vs 35%), senza influire sulla sterilità degli animali (87% vs 83%). Queste differenze possono essere associate al background genetico degli uccelli (polli da carne contro strati) e alla qualità del guscio d'uovo, che è probabile che sia più fragile nelle uova degli animali SPF, tenuti in allevamento chiuso per più di 40 anni. Inoltre, mostriamo anche che il trasporto di più di 2 ore (dalle fattorie alla struttura sperimentale) non influisce sull'efficienza e sulla qualità della schiusa.
Sebbene il processo di sterilizzazione utilizzato per gli isolatori da cova e il protocollo per la decontaminazione delle uova siano stati ottimizzati, circa il 10% degli isolatori non era privo di germi. Per comprendere l'origine della contaminazione, è molto importante effettuare il controllo di routine della sterilità degli isolatori nati prima dell'introduzione delle uova.
Per quanto riguarda lo stato di sterilità degli uccelli, abbiamo cercato di applicare metodi che consentano la crescita di batteri anaerobici aerobici e nonfastidi da campioni fecali, assicurando così che stiamo rilevando batteri vivi e vitali. Questi metodi sono conformi alle farmacopee internazionali per i test di sterilità e rappresentano tecniche rapide, facili e a costi ridotti da utilizzare abitualmente. Tuttavia, tecniche di biologia molecolare come il sequenziamento del gene rRNA 16S, sebbene non forniscano informazioni sulla vitalità dei batteri, possono essere applicate per la conferma della presenza di batteri non coltivabili. In effetti, uno studio recente ha suggerito che alcuni batteri del microbiota dell'ovidotto materno sembrano essere trasferiti all'embrione attraverso l'albume, costituendo in seguito la maggior parte della popolazione batterica intestinale dell'embrione5. Inoltre, un altro studio ha suggerito che parte dei colonizzatori microbici ospitati nei primi embrioni sono stati ereditati dalle galline materne e l'abbondanza e la diversità microbica intestinale sono state successivamente influenzate da fattori ambientali e genetica dell'ospite durante lo sviluppo23. Tuttavia, i risultati di questi studi si basano sull'analisi della sequenza del DNA, in cui un gran numero di questi batteri potrebbe essere morto o non replicabile nell'albume d'uovo (notevolmente caricato con molecole antimicrobiche). Thomas e collaboratori16 hanno eseguito test di sterilità attraverso la valutazione di batteri aerobici e facoltativi coltivabili attraverso la caduta fecale su piastre BHI, evidenziando così l'efficienza dei metodi batteriologici standard per il controllo della sterilità priva di germi. Inoltre, nel protocollo proposto, abbiamo utilizzato il monitoraggio della crescita in brodo di tioglicolato con resazurina per essere in grado di rilevare la crescita di batteri anaerobici nonfastidi.
Già utilizzato per la produzione di quaglie e polli privi di germi, il protocollo è adattabile alla produzione di animali privi di germi dalla maggior parte degli uccelli nidificanti e offre prospettive per lo studio del contributo del microbiota alla fisiologia di questi animali. Oltre all'uso di questo modello per studiare le interazioni reciproche ospite-microbiota nell'intestino del pollame, potrebbe anche essere utile per la ricerca applicata. Ad esempio, potrebbe essere utilizzato per valutare la sicurezza e l'efficacia dei probiotici derivati da microrganismi commensali dell'intestino di pollo per migliorare la salute e la robustezza degli animali.

C'è stato un drammatico aumento dell'interesse scientifico e popolare per quanto riguarda il contributo del microbiota intestinale alla salute degli animali. Il microbiota, costituito da batteri, virus, funghi e archei che abitano diverse nicchie nell'intestino dell'animale, è implicato direttamente o indirettamente nella regolazione di malattie infiammatorie, infettive e metaboliche che colpiscono non solo le specie di mammiferi ma anche il bestiame, come il pollame1. Sono stati sviluppati diversi modelli animali per studiare meglio il contributo del microbiota intestinale alla salute e alla malattia. Ad esempio, gli animali privi di germi e gnotobiotici consentono lo studio della completa assenza di microbi o di un microbiota noto, rispettivamente, sulla fisiopatologia delle infezioni 2,3. Tuttavia, la generazione e il mantenimento di questi animali richiede tecniche e strutture specializzate e i costi, la manodopera e le competenze necessarie per mantenerli limitano il loro accesso a molti ricercatori. In effetti, gli animali privi di germi devono essere monitorati regolarmente per possibili contaminazioni utilizzando una combinazione di metodi di coltivazione batterica, microscopia, sierologia, morfologia grossolana e tecniche di rilevamento basate sul sequenziamento. Procedure simili si applicano anche ad altre specie, come il bestiame, dove gli animali sono generalmente più grandi e richiedono strutture più grandi per il loro allevamento e mantenimento, il che può ostacolare, in una certa misura, la ricerca sul microbiota.
Il pollame, in particolare i polli, è la pietra angolare della produzione zootecnica in tutto il mondo, con una popolazione di gregge che può superare i 40 miliardi di uccelli all'anno. È la più importante fonte di proteine animali al mondo (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Inoltre, non ci sono tabù culturali o religiosi associati all'allevamento o al consumo di polli. Il microbiota intestinale del pollame è coinvolto in modo importante nella crescita degli animali, nel rapporto di conversione del mangime, nell'immunità, nella resistenza agli agenti patogeni, tra molti altri processi nutrizionali, fisiologici o patologici4. La generazione di polli privi di germi è quindi indispensabile per sottolineare il dialogo tra il microbiota e il suo ospite4. Anche se le comunità microbiche abitano l'ovidottodi pollo 5, il contenuto di un uovo appena deposto da una gallina sana è per lo più privo di microrganismi, il guscio d'uovo e le membrane possiedono barriere meccaniche per evitare l'invasione di microrganismi4. Inoltre, i pulcini sono facilmente allevati in assenza dei loro parenti, il che, a differenza dei mammiferi, consente la produzione di animali privi di germi senza l'allevamento dei genitori in condizioni sterili.
La struttura sperimentale "Infettivologia dell'allevamento, del modello e degli animali selvatici" (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Francia, https://doi.org/10.15454/1.5572352821559333e12) fa parte della rete infrastrutturale nazionale francese EMERG'IN (https://www.emergin.fr/). PFIE ha padroneggiato la produzione di polli privi di germi per eseguire vari studi sperimentali per più di 40 anni 7,8,9,10,11. Questi animali sono stati prodotti da uova specifiche prive di agenti patogeni (SPF) da una linea di deposizione livorno bianca allevate in allevamento chiuso dal 1970. Utilizzato principalmente per studi microbiologici 7,8,9, gli uccelli privi di germi stanno vivendo una rinascita di interesse con domande come il contributo del microbiota intestinale al comportamento13, l'utilizzo dei nutrienti14, lo sviluppo immunitario15 e l'attività endocrina. Anche se alcuni studi sono stati pubblicati utilizzando linee di polli da carne prive di germi16, questi studi rimangono sottorappresentati rispetto agli studi che utilizzano linee di strati sperimentali. L'evoluzione delle questioni scientifiche verso la diafonia tra il microbiota e il suo ospite nella salute e nel benessere del pollame ci ha portato ad adattare il nostro protocollo storico per produrre polli da carne privi di germi della linea Ross PM3, la linea di polli da carne più utilizzata al mondo.

<table><tbody><tr><td>2 mL sterile plastic pipettes</td><td>Starsted</td><td>86.1252.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI agar plates</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>PO1198A</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion broth</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL BHI broth</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Hatching incubator</td><td>Fieme</td><td>MG 576</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td></td><td>for bacteriological culture, 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Irradiated feed</td><td>Safe</td><td>U8983G10R</td><td>40 kG irradiated</td></tr><tr><td>Isolators</td><td></td><td></td><td>home made. 1 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; rigid isolator under positive pressure</td></tr><tr><td>Microbiological safety cabinet</td><td>thermon electron corporation</td><td></td><td>model: Hera Safe</td></tr><tr><td>Microscope Visiscope series 300</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette aid</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile sealed boxes</td><td>Tuperware</td><td></td><td>diameter</td></tr><tr><td>Sterilized glass tube</td><td></td><td></td><td>&quot;sovirel&quot;</td></tr><tr><td>Thioglycolate Broth with Resazurin</td><td>Merck</td><td>90404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &amp;deg;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td></tr></tbody></table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Gli studi sul contributo del microbiota intestinale alla fisiologia e all'immunocompetenza dell'ospite sono facilitati dalla disponibilità di modelli animali privi di germi, che sono considerati il gold standard. Gli uccelli nidificanti sono modelli ideali per la produzione di animali privi di germi poiché non è necessario allevare i loro parenti in condizioni sterili. I polli privi di germi sono generati principalmente da linee sperimentali prive di agenti patogeni specifici (SPF), che sono scarsamente rappresentative delle linee di pollo commerciali. Il metodo qui proposto ha permesso la produzione di polli privi di germi dalla linea di polli da carne a crescita rapida Ross PM3, comunemente utilizzata dall'industria avicola. Le uova sono state rapidamente raccolte dopo la deposizione in una fattoria di allevatori di polli da carne. Hanno subito un rigoroso processo di decontaminazione dalla raccolta all'introduzione in un isolatore sterile per la schiusa delle uova. I pulcini sono stati schiusi e tenuti in questi isolatori sterili durante il periodo necessario per controllarne la sterilità. Originariamente sviluppato per una linea sperimentale SPF a livorno bianca, il presente protocollo è stato adattato non solo alla linea di polli da carne Ross PM3 ma anche alle quaglie. Rappresenta pertanto una procedura robusta e facilmente adattabile ad altre specie avicole e ai volatili nidificanti di rilevanza economica, biologica o ecologica.

Sei cicli di generazione di pulcini privi di germi sono stati condotti con uova Ross PM3 provenienti da due diversi allevamenti francesi (Tabella 1). Sono state raccolte un totale di 853 uova e dopo due fasi di decontaminazione e 19 giorni di incubazione, l'86,40% era vitale. 490 di queste uova vitali hanno subito una terza fase di decontaminazione e sono state introdotte in vari isolatori da cova, per un tasso medio di schiusa del 79,80%. Ciò rappresenta un tasso di schiusa del 68,94% rispetto al numero iniziale di uova raccolte.
Tuttavia, i risultati della schiusa variano sostanzialmente a seconda delle serie effettuate: dal 41,67% all'88,16% dei pulcini vitali rispetto al numero di uova raccolte. Queste variazioni sono state osservate anche tra i diversi boccaporti durante lo stesso esperimento. Poiché non tutti gli isolatori sono stati utilizzati per tutte le corse, è difficile escludere un effetto dipendente dall'isolatore. Tuttavia, questo effetto batch era direttamente correlato all'età delle galline ovaiole (Figura 1), dove le uova provenienti da galline più anziane erano meno vitali.
Le sei corse sono state effettuate utilizzando quattro diversi isolatori di schiusa. Dopo il controllo batteriologico, gli animali di 14 dei 16 isolatori sono stati confermati privi di germi. Ciò corrisponde a un tasso di successo dell'87,5%. I due isolatori rimanenti sono stati contaminati da un singolo batterio ambientale e non patogeno.
Tutti gli animali utilizzati per gli esperimenti scientifici sono rimasti privi di germi fino alla fine degli studi, per almeno tre settimane dopo la schiusa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Figura 1: Effetto dell'età della gallina sul tasso di schiusa La presente cifra evidenzia i tassi di schiusa osservati in base all'età del gregge di galline ovaiole, espressa in settimane di deposizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Uova raccolte</td>
			<td>D19 uova vitali</td>
			<td>D19 uova vitali/uova raccolte</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 1</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 2</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 3</td>
			<td>Uova trasferite in isolatore 4</td>
			<td>totale delle uova trasferite</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 1</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 2</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 3</td>
			<td>pulcini vitali nati nell'isolatore 4</td>
			<td>totale dei pulcini nati vitali</td>
			<td>isolatore vitale di uova schiuse/trasferite1</td>
			<td>isolatore vitale di uova tratteggiate/trasferite2</td>
			<td>isolatore vitale di uova schiuse/trasferite3</td>
			<td>isolatore vitale di uova schiuse/trasferite4</td>
			<td c="">uova schiuse/trasferite vitali a livello globale</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Corsa 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totale</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Risultati tecnici dei diversi esperimenti di schiusa. La presente tabella evidenzia i risultati delle 6 serie di schiusa germ-free effettuate: numero di uova raccolte, vitalità dell'embrione a 19 giorni e pulcini nati vitali nei vari isolatori.

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Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Qui descriviamo un metodo per la generazione di pulcini privi di germi dalle uova di una linea di polli da carne commerciale, il Ross PM3. Questo metodo può essere adattato per la generazione di animali privi di germi da altre specie di pollame.

Produzione di polli da carne a crescita rapida privi di germi da una linea commerciale per studi sul microbiota

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K Views.  INRAE, PFIE, UE-1277. Qui descriviamo un metodo per la generazione di pulcini privi di germi dalle uova di una linea di polli da carne commerciale, il Ross PM3. Questo metodo può essere adattato per la generazione di animali privi di germi da altre specie di pollame.

Video: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Allevamento la mosca della frutta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sotto axeniche e Gnotobiotic Condizioni

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial community assembly. This protocol outlines a system for studying microbial community dynamics in the phyllosphere of Napa cabbage plants. It describes how to grow germ-free plants in test tubes with a calcined clay and nutrient broth substrate. Inoculation of germ-free plants with specific microbial cultures provides opportunities to measure microbial growth and community dynamics in the phyllosphere. Through the use of sterile vegetable extract produced from cabbages shifts in microbial communities that occur during fermentation can also be assessed. This system is relatively simple and inexpensive to set up in the lab and can be used to address key ecological questions in microbial community assembly. It also provides opportunities to understand how phyllosphere community composition can impact the microbial diversity and quality of vegetable fermentations. This approach for developing gnotobiotic cabbage phyllosphere communities could be applied to other wild and agricultural plant species.

A method of growing germ-free Napa cabbages has been developed which enables researchers to evaluate how single microbial species or multispecies microbial communities interact on cabbage leaf surfaces. A sterile vegetable extract is also presented which can be used to measure shifts in community composition during vegetable fermentation.

Un sistema gnotobiotico per studiare l'assemblaggio del microbioma nella Phyllosphere e nella fermentazione vegetale

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Ambiente

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. Chicken embryos provide the opportunity to isolate preadipocytes from the earliest stage of adipose development. This primary cell can be used to identify factors influencing preadipocyte proliferation and adipogenic differentiation, making them a valuable model for studies related to childhood obesity and control of excess fat deposition in poultry. The rapid growth of postnatal adipose tissue effectively wastes feed by allocating it away from muscle growth in broiler chickens. Therefore, methods to understand the earliest stages of adipose tissue development may provide clues to regulate this tendency and identify ways to limit adipose expansion early in life. The present study was designed to develop an efficient method for isolation, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes isolated from developing adipose tissue of commercial broiler (meat-type) chick embryos. The procedure has been optimized to yield cells with high viability (~98%) and increased capacity to differentiate into mature adipocytes. This simple method of embryonic preadipocyte isolation, culture, and differentiation supports functional analyses of fat growth and development in early life.

The present protocol describes a simple method for isolating preadipocytes from adipose tissue in broiler embryos. This method enables isolation with high yield, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes. Oil Red O staining and lipid/DNA stain measured the adipogenic ability of isolated cells induced with differentiation media.

Isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pulcino di pollo

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

Ottimizzazione dei modelli GF Zebrafish: generazione, manutenzione e studi microbici

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autore in primo piano: Definizione di pesce zebra privo di germi per studi sulla relazione microbiota-ospite

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of the specific role of individuals, defined or complex groups of microorganisms in host response. Traditionally bred and reared in flexible-film or semi-rigid isolators, germ-free mouse husbandry and experimental manipulation are costly and require numerous trained staff and a large space footprint in animal housing facilities. The IsoPositive caging system allows for experimental manipulation of germ-free mice in individual, hermetically-sealed, positive-pressure isolator cages (isocages), reducing cost and enabling greater flexibility in experimental manipulations. 
Here, a protocol is described for transferring germ-free mice from breeding isolators to isocages and subsequent fecal transfer from human donor stool into mice to create stable long-term gut "humanized" mice for future studies. The materials and preparation needed for the utilization of the isocage system are described, including the use of chlorine-dioxide sterilant chemical sterilant to clean cages, supplies, equipment, and personal protective equipment. The methods for confirming the germ-free status of transferred mice and how to determine contamination in the caging system are discussed. The procedure for husbandry, including bedding, food, and water supply, is further discussed. The protocol for human fecal slurry preparation and gavage into germ-free mice to create gut "humanized" mice, along with stool collection to monitor the microbial community composition of these mice, are described. An experiment illustrates that two weeks post-human fecal transplant allows for stable colonization of donor microbiota in the murine hosts, enabling subsequent experimental usage. Furthermore, the collection of humanized mouse feces in viability preservation media, enabling use in further functional experiments, is described. Overall, these methods allow for the safe and effective establishment of humanized mouse communities in experimental gnotobiotic cages for further manipulation.

This protocol describes the best practices for germ-free mouse transfer to and housing in experimental single-cage isolators (isocages) while maintaining sterile conditions. Methods for fecal transplant into germ-free mice and the collection of viable bacteria from these gut "humanized" mice for further applications are discussed.

Preparazione e mantenimento dell'esperimento in gabbia isopositiva per bioesclusione per il trapianto fecale umano in topi privi di germi

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

Immunologia e infezioni

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Istituzione e manutenzione di scarafaggi americani gnotobiotici (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Biologia

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain into an axenic insect is a powerful method to verify gut microbial function and elucidate the mechanisms underlying gut microbe-host interactions. Administering antibiotics or sterilizing egg surfaces are two commonly used methods to remove gut bacteria from insects. However, in addition to the potential adverse effects of antibiotics on insects, previous studies indicated that feeding antibiotics could not eliminate gut bacteria. Thus, germ-free artificial diets are generally employed to maintain axenic insects, which is a tedious and labor-intensive process that cannot fully resemble nutritional components in natural food. Described here is an efficient and simple protocol to prepare and maintain axenic larvae of a leaf beetle&#160;(Plagiodera versicolora). Specifically, surfaces of the beetle eggs were sterilized, following which germ-free poplar leaves were used to rear axenic larvae. The axenic status of the insects was further confirmed via culture-dependent and culture-independent assays. Collectively, by combining egg disinfection and germ-free cultivation, an efficient and convenient method was developed to obtain axenic P. versicolora, providing a readily transferable tool for other leaf-eating insects.

To obtain an axenic insect, its egg surface is sterilized, and the hatched larva is subsequently reared using axenic leaves. This method provides an efficient way for axenic insect preparation without administering antibiotics or developing an artificial diet, which can also be applied to other leaf-eating insects.

Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Studiare lo sviluppo di Axenic Delia antiqua e garantire una crescita priva di batteri

Rearing Axenic Delia antiqua with Half-Fermented Sterile Diets

Axenic insects are obtained from sterile artificial rearing systems using sterile media. These insects, characterized by their small size, short growth cycle, and low feed requirements, are ideal for studying the relationship between microorganisms and hosts. The gut microbiota significantly influences the physiological characteristics of insect hosts, and introducing specific strains into axenic insects provides a method for verifying gut microbial functions. Delia antiqua, a threatening pest in the order Diptera, family Anthomyiidae, and genus Delia, primarily feeds on onions, garlic, leeks, and other vegetables of the family Liliaceae. Its larvae feed on the bulbs, causing rotting, wilting, and even death of entire plants. By rearing axenic larvae, follow-up studies can be conducted to observe the effects of intestinal microflora on the growth and development of D. antiqua. Unlike the method involving antibiotic elimination of associated microbes, this article presents a low-cost and high-efficiency approach to raising axenic D. antiqua. After surface sterilization of D. antiqua eggs, half-fermented sterile diets were used to raise larvae, and the axenic state of D. antiqua was verified through culture-dependent and culture-independent assays. In conclusion, the combination of insect egg sterilization and the preparation of sterile diets for larval culture has enabled the development of an efficient and simple method for obtaining axenic D. antiqua. This method provides a powerful approach to studying insect-microflora interactions.

Autore in primo piano: Allevamento axenico di Delia antiqua per rilevare l'impatto dei microbi intestinali sulla sua crescita e sviluppo 

A simple procedure for rearing axenic Delia antiqua with half-fermented sterile diets is described. Only one Wolbachia strain was detected in each instar of axenic D. antiqua using PCR.

Allevamento di Axenic Delia antiqua con diete sterili semifermentate

Axenic insects are obtained from sterile artificial rearing systems using sterile media. These insects, characterized by their small size, short growth ...

Produzione di polli da carne a crescita rapida privi di germi da una linea commerciale per studi sul microbiota

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Allevamento la mosca della frutta

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Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

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Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

Allevamento di Axenic Delia antiqua con diete sterili semifermentate