Questo protocollo facilita la preparazione e la somministrazione di un cocktail virale e fago contro pseudomonas aeruginosa negli embrioni di zebrafish. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente una valutazione in vivo dell'efficacia del fago nel contrastare l'infezione batterica. Il cocktail di fago è efficiente sia nei modelli zebrafish di tipo selvatico che cystic fibrosi.
Apertura della possibilità di applicare la terapia del fago alle infezioni batteriche nei pazienti con fibrosi cistica. La terapia del fago può anche essere applicata per contrastare specifiche infezioni batteriche in altri sistemi modello. Per preparare un fago per l'esperimento.
Aggiungere 1,25 per 10 al settimo fagi a un OD 600 della cultura di 0,05 P.aeruginosa a una molteplicità di infezione da uno per 10 a tre negativi e incubare la coltura per tre o quattro ore con tremori fino a quando l'OD 600 scende a 0,1 a 0,3. Al termine dell'incubazione incubare il lisato con un microgrammo per millilitro di DNAsi e RNAsi per 30 minuti a 37 gradi Celsius. E pellettò le cellule per centrifugazione.
Al termine del filtro di centrifugazione il supernatante attraverso un diametro del poro di 0,8 micrometri e aggiungere 58 grammi per litro di cloruro di sodio e 105 grammi per litro di PEG 6000. Incubare la soluzione a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, precipitare il fago per centrifugazione.
Al termine della centrifugazione rimuovere il supernatante e sciogliere con cura il pellet di fago in 15 millilitri di tampone di cloruro di sodio Tris. Per purificare i fagi mediante gradiente di densità del cloruro di cesio, prima stratificare due millilitri di quattro diverse soluzioni di cloruro di cesio in tubi di poliallomero ultracentrifugo per un rotore SW 41 e aggiungere 3,5 millilitri della sospensione del fago a ciascun tubo. Il cloruro di cesio è tossico.
Adottare sempre procedure di sicurezza adeguate durante la manipolazione e lo scarto di questo composto. Una volta caricati tutti i tubi, posizionare i tubi nel rotore facendo attenzione che i tubi siano bilanciati. E centrifugare i campioni per due ore a 100.000 volte g e quattro gradi Celsius.
Al termine della centrifugazione, utilizzare una siringa con un ago calibro 19 per aspirare lo strato bianco tra la D uguale a 1,5 e la D è uguale a 1,4 regioni di densità. E trasferire le sospensioni in nuovi tubi in poliallomero sw 60. Centrifugare le sospensioni per almeno 16 ore a 150.000 volte g e quattro gradi Celsius.
E trasferire le bande visibili in tubi di dialisi con un taglio di 6.000 Dalton. Quindi dializzare i campioni raccolti due volte contro 500 millilitri di acqua per 20 minuti per dialisi e durante la notte contro 500 millilitri di tampone di cloruro di sodio Tris. La mattina seguente, filtrare il materiale fago risultante con un filtro poro di 0,22 micro metri e conservare il magazzino a quattro gradi Celsius.
Il giorno della micro iniezione diluire due soluzioni di morpholinos micromolare in acqua sterile ad una concentrazione finale di 0,25 picomolare per embrione per ottenere una soluzione di iniezione di morfolino a cinque microliter. E aggiungere 0,5 microlitri di rosso fenolo ad ogni soluzione. Successivamente utilizzare una micropipetta da 20 microliter con una punta di caricamento in gel fine per caricare un micro ago di iniezione con l'intero volume di soluzione mista di morfolino e fissare l'ago a un micro manipolatore collegato a un supporto al microscopio stereo.
Quindi, con una o due cellule, embrioni di pesce zebra disposti su uno scivolo di vetro posto all'interno di una piastra di Petri di 96 millimetri di diametro, penetrano nel corore e nel tuorlo con la punta dell'ago a micro iniezione e iniettano due nanolitri della miscela di morfina nell'embrione. A 26 ore dalla fecondazione, caricare un micro ago di iniezione con circa cinque microlitri di P.aeruginosa inoculum e inserire l'ago dorsalmente al punto di partenza del condotto di Cuvier in cui il condotto inizia a diffondersi sul sacco del tuorlo. Iniettare uno o tre nanolitri dell'inoculo PAO1 nell'embrione assicurandosi che il volume si espanda direttamente all'interno del condotto ed entri nella circolazione.
Dopo l'iniezione trasferire l'embrione in una delle due nuove piastre di Petri contenenti mezzo fresco E3 integrato con feniltiourea per un'incubazione di 30 minuti o tre ore a 28 gradi Celsius. Successivamente, caricare un micro ago di iniezione con circa cinque microlitri del cocktail di fago e fissare l'ago al micro iniettore. Quindi iniettare da uno a tre nanolitri di cocktail di fago nel condotto di Cuvier di ogni embrione precedentemente iniettato con batteri e posizionare gli embrioni in una delle due nuove piastre di Petri contenenti mezzo fresco E3 integrato con feniltiourea a 28 gradi Celsius.
A quattro ore dalla post-infezione, utilizzare una pipetta di plastica per trasferire un embrione anestetizzato in un piatto di fondo di vetro. E riempire il piatto con una soluzione calda di agarosio a basso punto di fusione. Quando l'agarosio è freddo, riempire delicatamente il piatto con mezzo E3 integrato con soluzione anestetica.
Posizionare il piatto al microscopio stereo e utilizzare una punta di pipetta per posizionare l'embrione nell'orientamento desiderato. Quindi posizionare il piatto sotto un microscopio stereo fluorescente con un filtro fluorescente per batteri positivi alla GFP per un massimo di 18 ore dopo l'infezione e l'immagine dell'embrione per la progressione dell'espressione della GFP a nove, 14 e 18 ore dopo l'infezione. Per determinare il carico batterico a otto ore dopo l'infezione, trasferire 15 embrioni microiniettati anesteti in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e sostituire la soluzione anestetica con 300 microlitri dell'1%Triton X-100 in PBS.
Passare gli aghi attraverso l'ago sterile calibro 27 di una siringa per insulina almeno 15 volte per omogeneizzare gli embrioni. E preparare le diluizioni seriali dell'omogeneato trasferendo 100 microlitri della miscela risultante in 900 microlitri di PBS sterile per diluizione. Per selezionare il ceppo P.aeruginosa naturalmente resistente all'ampicillina, placcare 10 microlitri delle diluizioni sull'agar LB integrato con ampicillina e incubarli durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno dopo conta il numero di colonie. Per consentire il calcolo del numero totale di unità di formazione della colonia e del numero medio di unità di formazione della colonia per embrione infetto. Per valutare la letalità dell'infezione da P.aeruginosa segnare gli embrioni iniettati a 20 ore dopo l'infezione al microscopio stereo contando il numero di embrioni bianchi opachi morti.
Quindi calcolare la mezza concentrazione letale massima 50 dose di P.aeruginosa che ha portato alla morte del 50% degli embrioni iniettati a 20 ore dopo l'infezione. Per convalidare il fenotipo della fibrosi cistica è possibile valutare la posizione compromessa degli organi interni come il fegato cardiaco e il pancreas. Il carico batterico è ridotto dalla terapia del fago negli embrioni di fibrosi cistica infettati da P.Aeruginosa.
In 48 ore dopo la fecondazione gli embrioni di fibrosi cistica infettati da batteri P.Aeroginosa positivi alla GFP, una colonia di 30 unità formatrici per dose embrionale dimostra una letalità del 50% a 20 ore dopo l'infezione. La terapia del fago è altrettanto efficace a 20 ore dopo l'infezione quando viene consegnata 30 minuti o sette ore dopo l'iniezione batterica. Qui, viene mostrata una fibrosi cistica e un embrione positivo alla GFP P.Aeruginosa iniettato a quattro, nove, 14 e 18 ore dopo l'infezione.
Al contrario, la fibrosi cistica più P.Aeruginosa più l'embrione iniettato di fago dimostra una ridotta fluorescenza dovuta all'azione del fago contro i batteri. La risposta infiammatoria generata dall'infezione da P.aeruginosa negli embrioni di fibrosi cistica è significativamente aumentata come rivelato dall'espressione delle citochine pro-infiammatorie, TNF alfa e interleuchina 1 beta a seguito dell'iniezione di P.aeruginosa rispetto al controllo del pesce zebra iniettato. Tuttavia, l'espressione di entrambe le citochine infiammatorie è ridotta negli animali co-iniettati di cocktail di fago.
I fagi devono essere accuratamente purificati per rimuovere eventuali endotossine contaminanti che possono essere trattenute durante il preparato. I preparati del fago possono essere analizzati mediante microscopia elettronica per valutare la morfologia del virione. Sarebbe interessante verificare se l'infezione nei pazienti umani da parte di batteri diversi dalle pseudomonas aeruginosa può essere curata con la terapia del fago nel modello del pesce zebra della fibrosi cistica.
