La fibrosi tissutale è il modo principale in cui gli organi falliscono nel tempo, in risposta all'infiammazione cronica o all'invecchiamento. E infatti, direi che se non muori per un agente infettivo o un cancro, probabilmente morirai per fibrosi d'organo man mano che invecchiate. Sfortunatamente, non ci sono molti ottimi modelli di topi per imitare la fibrosi dei tessuti umani.
Quello che abbiamo sviluppato è un modello di topo della malattia di Crohn, che è una malattia umana che causa fibrosi intestinale ed è in gran parte intrattabile. In effetti, l'unico modo in cui puoi trattarlo è attraverso la rimozione chirurgica del tessuto fibrotico e la ri-legatura dell'intestino. Il vantaggio del nostro modello è che è completamente penetrante in tutti i ceppi di topi e imita molto da vicino la malattia di Crohn umana e la fibrosi persiste per oltre un mese, che è davvero un modello robusto.
La parte più impegnativa di questa procedura è la gestione dei topi e in particolare il gavage orale poiché ciò richiede molta pratica di certificazione speciale. Quando si esegue questa procedura per la prima volta, si dovrebbe essere consapevoli del fatto che lavorare con Salmonella richiede adeguate precauzioni di sicurezza e tecnica sterile. Lo smaltimento dei rifiuti e dei batteri dovrebbe essere pianificato prima dell'esperimento.
La dimostrazione visiva di questa procedura è molto importante perché comporta la manipolazione della Salmonella che richiede speciali precauzioni di sicurezza e una corretta tecnica sterile. Per iniziare questa procedura, impostare una piastra con agar LB contenente Streptomicina ad una concentrazione di 100 microgrammi per millilitro. Utilizzando un anello inoculato sterile, striare la piastra con uno stock di glicerolo congelato di S typhimurium delta arrow a.
Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius. Le piastre a strisce possono essere conservate a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Un giorno prima dell'infezione, sciogliere 0,5 grammi di Streptomicina in 2,5 millilitri di acqua per preparare l'antibiotico.
Filtrare sterilizzare la soluzione di Streptomicina. Quindi, utilizzare un ago di gavage a punta di bulbo calibro 22 con una siringa millilitro per gavage orale dei topi con 100 microlitri della soluzione di streptomicina. Successivamente, aggiungere tre millilitri di brodo LB contenenti Streptomicina ad una concentrazione di 50 microgrammi per millilitro a un tubo di coltura.
Usando un ciclo di inoculazione, inoculare il brodo LB con una singola colonia. Incubare la coltura aerobicamente durante la notte a 37 gradi Celsius con tremori a 200 giri/min. Il giorno dell'infezione, eseguire due diluizioni consecutive da una a 10 delle colture di Salmonella durante la notte con PBS sterile per preparare la dose finale di infezione.
Ciò si traduce in un inoculo da 100 microlitri contenente circa tre milioni di unità di formazione di colonie. Successivamente, utilizzare un ago da gavage a punta di bulbo calibro 22 con una siringa millilitro per gavage ogni topo con 100 microlitri della Salmonella preparata. In primo luogo, impostare due microtubi inferiori rotondi a serratura sicura millilitro, aggiungere un millilitro di PBS sterile e un tallone in acciaio inossidabile autoclavato a ciascun tubo.
Pre-pesare i tubi prima della raccolta dei tessuti. Dopo aver eutanasiato i topi, resect i loro tessuti cecali e splenici, assicurandosi di raccogliere i tessuti dai singoli animali in tubi separati. Pesare ogni tubo per determinare i pesi dei tessuti.
Utilizzare un apparato di mulino miscelatore per omogeneizzare i tessuti a 30 hertz per 15 minuti. Quindi, trasferire 900 microlitri di PBS in ogni pozzo di un megablocco da 96 pozzetti da due millilitri. Pipettare 100 microlitri di tessuto omogeneizza nel primo pozzo e mescolare bene.
Eseguire diluizioni seriali aggiungendo 100 microlitri ai pozzi successivi, fino a ottenere una diluizione 10 alla sesta diluizione negativa. Piastra 10 microlitri di ogni diluizione in triplicati su agar LB che contiene Streptomicina. Quindi, contare le unità medie di formazione della colonia e determinare le unità di formazione della colonia per grammo di tessuto come delineato nel protocollo di testo.
Aprire Fiji, che è un software di imaging open source e trascinare e rilasciare il file di immagine tif sulla barra degli strumenti. Sulla barra dei menu selezionare Immagine, Tipo, Pila RGB per dividere l'immagine in canali rosso, verde e blu. Far scorrere la barra orizzontale nella parte inferiore del pannello per impostare il canale su verde.
Apri immagine, Regola, Soglia. Regolare i limiti minimi e massimi per eliminare eventuali segnali di fondo. Una volta impostata la soglia desiderata, chiudere lo strumento soglia e passare a Analizza, Imposta misure, controlla area, Frazione area, Limite alla soglia ed etichetta di visualizzazione.
Ottenere la selezione dei tessuti con lo strumento selezioni a mano libera o poligono e misurare l'area percentuale positiva per il collagene facendo clic su Analizza, Misura. Quindi, normalizza l'area assoluta positiva per la colorazione del collagene nell'area tissutale. Il trattamento con streptomicina seguito da infezione orale con s typhimurium delta arrow a porta a robusta infiammazione intestinale e fibrosi, specialmente nel cieco.
I tipici fardelli patogeni da 100 milioni a un miliardo di unità di formazione di colonie possono essere recuperati per grammo di cieco da animali infetti, mentre 10 mila unità di formazione di colonie possono in genere essere recuperate per grammo di milza. La valutazione della fibrosi nelle sezioni cecali macchiate di picrosirius rosso indica una fibrosi di picco 21 giorni dopo l'infezione, mentre gran parte della patologia viene risolta entro il giorno 42 dopo l'infezione. Una preparazione accurata dei materiali è essenziale in quanto questo esperimento richiede più giorni per essere impostato.
La preparazione delle placche LB e della Salmonella e della Streptomicina deve essere effettuata in modo asettico. Prima dell'esperimento, assicurarsi che lo sperimentatore abbia familiarità con il protocollo animale e i rischi per la sicurezza. Dopo aver valutato il carico di collagene, lo sperimentatore può scegliere di eseguire altri saggi biologici, come il sequenziamento dell'RNA per valutare i profili di espressione genica o la citometria del flusso per valutare i sottoinsiemi delle cellule immunitarie o un ELISA tissutale per valutare i profili delle citochine.
Quindi il nostro modello è particolarmente bravo a imitare una malattia umana chiamata malattia di Crohn in cui si ottiene la fibrosi dell'intestino, che è in gran parte intrattabile e l'unico modo per trattarla è rimuovere una sezione dell'intestino e riricucirla insieme e sperare che non torni. Il nostro modello è molto robusto e abbiamo già dimostrato che colpire le cellule linfoidi innate di tipo tre, un fattore di trascrizione chiamato alfa grezzo, o interleuchina 17 migliora la malattia e previene la fibrosi. Il nostro modello è particolarmente bravo a identificare i fattori che giocano nella patogenesi della malattia di Crohn e della fibrosi intestinale e siamo già sulla strada per identificare una serie di obiettivi che potrebbero essere trattati terapeuticamente per alleviare la malattia infiammatoria intestinale.
Il nostro modello è già entrato nello stesso accesso ILC3 o alfa NIL17 può essere in gioco in altre malattie fibrotiche e queste includono cose come psoriasi, sclerosi multipla, fibrosi polmonare idiopatica. Quindi è possibile che mirare a questi stessi fattori possa alleviare la fibrosi anche in quelle malattie. Sebbene il flusso mutante di Salmonella non sia virulento, è importante seguire i protocolli di sicurezza biologici standard forniti dalla struttura.
Inoltre, poiché i vapori di formaldeide sono noti per essere cancerogeni, è importante lavorare dietro una cappa aspirante durante la fase di fissazione.
