In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo per fabbricare un dispositivo basato su carta chiamato XO Pad, progettato per l'arricchimento efficace in isolamento delle vescicole extracellulari. XO Pad è un semplice dispositivo in grado di pre-concentrare e isolare la vescicola extracellulare senza l'uso di sostanze chimiche o macchine di lavoro, mostrando al contempo tassi di recupero più elevati rispetto ai metodi convenzionali. Iniziare definendo l'area da stampare con il software della stampante.
Il design dovrebbe avere 12 strati a cera in cui i diametri delle aree circolari del campione si restringono gradualmente da cinque a due millimetri. Quindi, stampare la cera idrofobica sulle regioni designate su entrambi i lati della carta di cellulosa. Posizionare la carta stampata in cera in un forno da laboratorio per 80 secondi a 120 gradi Celsius, quindi tagliare la carta stampata in cera con una fresa per realizzare singoli dispositivi XO Pad.
Rilascia rispettivamente un cinque e due microlitri di membrana selettiva perm sulle aree campione nella maggior parte sinistra e destra della maggior parte degli strati. Posizionare gli strati codificati con la membrana selettiva perm su una piastra calda a 70 gradi Celsius per 30 minuti per evaporare il solvente. Quindi sigillare la superficie più esterna dello strato rivestito di fronte alla soluzione tampone con nastro sensibile alla pressione, lasciando un piccolo foro.
Piegare il dispositivo XO Pad avanti e indietro lungo le linee bianche per collegare conver delicatamente tutte le aree campione. Pipettare 15 microlitri della microvesicola e del campione esosoma nelle aree del campione convergenti e attendere alcuni secondi per garantire una completa bagnatura. Posizionare due camere acriliche ad entrambe le estremità del pad XO e bloccarlo saldamente con piccole clip leganti per evitare lo svolgimento.
Riempire le camere con 110 microlitri di 0,1X PBS e inserire due elettrodi d'argento. Quindi utilizzare un sistema di misurazione della sorgente di tensione di corrente per applicare 30 volt agli elettrodi per 20 minuti. Per isolare le microvesicelle ed esosomi arricchiti, separare il pad XO piegato dalle camere acriliche e aprire il dispositivo per isolare le particelle arricchite dagli altri strati.
Perforare le aree campione negli strati otto e nove in cui le microvescicole e gli esosomi sono arricchiti per l'analisi a valle. È stato eseguito un saggio di migrazione time-lapse di microvesicelle ed esosomi etichettati fluorescentmente al fine di ottimizzare il tempo di funzionamento per il massimo recupero delle particelle arricchite. Le intensità di fluorescenza in tutte le aree campione sono state quantificate con il software ImageJ.
Prima del processo di arricchimento, le microvesicelle e gli esosomi erano dispersi in tutte le aree campione con una graduale diminuzione dell'intensità. Dopo 10 minuti di elaborazione, le particelle migrarono elettro-cineticamente e una spina istantanea di pre-concentrazione apparve sullo strato sette. Quando il tempo ha raggiunto i 20 minuti, microvescicole ed esosomi erano fortemente focalizzati sugli strati otto e nove e arricchiti di cinque volte in base alle intensità di fluorescenza.
L'integrità delle microvesicelle arricchite e degli esosomi nello strato otto è stata studiata con SEM. È stata inoltre analizzata la distribuzione delle dimensioni delle microvesicelle ed esosomi arricchiti.
Successivamente, è stata analizzata l'effettiva concentrazione delle microvesicelle arricchite e degli esosomi sulle aree campione negli strati sei, otto e 10. Nello strato otto, le microvescicole e gli esosomi erano pre-concentrati di un fattore 5,58, ma non è stata osservata alcuna preconcentrzione evidente negli altri strati. Per garantire la riproducibilità di questa procedura, ha seguito con precisione il protocollo per il tempo e la temperatura di incubazione del forno durante la verifica del dispositivo e il tempo di funzionamento del dispositivo perché queste sono le condizioni ottimizzate.
L'XO Pad può anche essere usato per separare e isolare la vescicola extracellulare da campioni ricchi di proteine, come siero o plasma, usando il tampone di carbonato. Questo protocollo può fornire uno strumento di preparazione efficiente e semplice, con le sue capacità di pre-concentrazione e isolamento necessarie per la ricerca clinica, come la diagnosi, la somministrazione di farmaci, l'immunoterapia e altre terapie.
