Questo metodo qRT-PCR può affrontare questioni relative al profilo di espressione dei microRNA nel siero di topi in condizioni come la compromissione renale dipendente dall'età. La tecnica consente il rilevamento dell'espressione di microRNA con elevata precisione e sensibilità mediante un semplice processo che consente di risparmiare tempo e prevenire errori tecnici. Per iniziare, incidi la pelle dell'addome usando pinzette e forbici chirurgiche.
Tagliare i muscoli della membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole. Sollevare la membrana peritoneale usando una pinzetta e fare un'incisione laterale nel bordo superiore con le forbici chirurgiche. Continuare l'incisione lungo il bordo più basso delle costole.
Identificare la vena cava inferiore utilizzando due tamponi di cotone inumiditi con PBS. Inserire un ago da 30 G collegato a una siringa da 1 millilitro nella vena cava inferiore e tirare la siringa. Estrarre lentamente l'ago per evitare l'emolisi.
Trasferire il sangue in un tubo spitz da 1 millilitro con eparina e mescolare invertendo. Centrifugare il tubo spitz per 10 minuti a 3000 volte G a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Prelevare 200 microlitri di campione di siero e aggiungere 1.000 microlitri di reagente di lisi a base di fenolo/guanidina. Vortice la miscela per 5 secondi e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio e mescolare capovolgendo il tubo 15 volte.
Incubare il campione a temperatura ambiente per 3 minuti, seguito da centrifugazione. Senza disturbare il pellet, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 450 microlitri di etanolo al 100% e vortice il tubo per 5 secondi.
Quindi caricare 700 microlitri del campione su una colonna di rotazione ancorata a membrana e centrifugarla. Scartare il flusso e aggiungere 700 microlitri di Wash Buffer 1 fornito nel kit. Centrifugare di nuovo ed eliminare il flusso continuo.
Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di Wash Buffer 2 per rimuovere i sali in tracce. Aggiungere 500 microlitri di etanolo all'80%, centrifugare e scartare il flusso dal tubo di raccolta. Centrifugare nuovamente la colonna di rotazione e trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri.
Quindi aggiungere 14 microlitri di acqua priva di RNasi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Ruotare nuovamente la colonna per 1 minuto a 15000 volte G a temperatura ambiente. Preparare una soluzione master mix e aggiungere 8 microlitri per pozzetto in un tubo a 8 pozzetti.
Aggiungere 12 microlitri dell'RNA totale estratto in ciascuna provetta e centrifugare la provetta per 15 secondi a 2000 volte G a temperatura ambiente. Posizionare il tubo in un termociclatore e avviare l'incubazione per sintetizzare il cDNA. Dopo l'incubazione, trasferire il cDNA in una provetta da microcentrifuga fresca.
Diluire il cDNA dieci volte con acqua distillata. Quindi vortice, seguito da centrifugazione per 5 secondi a 2000 volte G a temperatura ambiente. In una provetta per microcentrifuga, preparare la soluzione master mix come descritto nel protocollo di testo e vortice la soluzione.
Aggiungi aliquote da 22,5 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, seguita da 2,5 microlitri di cDNA. Sigillare la piastra utilizzando una pellicola adesiva e centrifugare la piastra per 30 secondi a 1000 volte G.Posizionare la piastra nel sistema di PCR in tempo reale. Modifica le impostazioni fornendo un nome per l'esperimento.
Quindi selezionare 96 pozzetti 0,2 millilitri come tipo di esperimento, CT comparativa come metodo di quantificazione, standard come modalità di funzionamento del sistema e reagenti SYBR Green come reagenti per rilevare la sequenza target. Fornire i nomi per il campione e il miRNA bersaglio in ciascun pozzetto. Assegna campioni duplicati, scegli un campione di riferimento e un controllo endogeno e seleziona nessuno per il colorante da utilizzare come riferimento passivo.
Per eliminare la contaminazione incrociata del reagente, impostare la trascrittasi inversa negativa e un controllo non-modello per l'espressione dei miRNA. Quindi assicurarsi che il volume di reazione sia impostato su 20 microlitri e che le condizioni di ciclo PCR siano impostate a 95 gradi Celsius per 15 minuti, quindi 40 cicli di denaturazione a 94 gradi Celsius per 15 secondi, ricottura a 55 gradi Celsius per 30 secondi ed estensione a 70 gradi Celsius per 30 secondi. Al termine del processo, fare clic su Analizza per analizzare i dati qRT-PCR.
Verificare che la linea di soglia selezionata automaticamente dal programma sia appropriata per ciascun pozzetto. Controllare il valore del ciclo soglia del controllo endogeno e dei miRNA bersaglio analizzati in ciascun campione. Determinare i valori CT mediante l'intersezione della curva di amplificazione e della linea di soglia.
I dati di qRT-PCR di miRNA per il modello di compromissione renale dipendente dall'età hanno mostrato che, rispetto ai topi di controllo SAMR1, il livello renale di miRNA-7219-5p è aumentato significativamente nei topi sperimentali SAMP1, mentre il livello renale di miRNA-7218-5p è diminuito. I livelli di espressione di miRNA-223-3p non sono cambiati in nessuno dei due ceppi. I livelli sierici di entrambi i miRNA-7219-5p e miRNA-7218-5p erano considerevolmente aumentati nei topi SAMP1, mentre i livelli di miRNA-223-3p erano invariati.
È necessario inserire l'ago nella vena cava inferiore ed estrarre il sangue senza penetrare nella nave. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel profilo di espressione dei microRNA nel siero dei topi per una vasta gamma di condizioni patologiche.
