Lo studio della risposta al danno del DNA è necessario per comprendere la fisiopatologia dei potenziali biomarcatori del cancro ovarico in nuove terapie mirate. Questa tecnica consente al campione di rimanere intatto e consente l'esame degli antigeni nella loro posizione d'azione. Questo protocollo è rapido e può essere adattato a qualsiasi antigene suscettibile di immunofluorescenza.
Questo metodo fornisce informazioni sul cancro ovarico e sui processi di riparazione del danno al DNA coinvolti nella resistenza chemioterapica e agli inibitori PARP. Questi metodi possono essere applicati ad altre aree di studio che prevedono l'uso di colture 3D e organoidi. Per iniziare, aspirare il mezzo dagli organoidi irradiati e incubati senza interrompere la matrice 3D.
Quindi lavare con 300 microlitri di PBS. Fissare gli organoidi in 300 microlitri di paraformaldeide al 2% per 10 minuti. Dopo il fissaggio, lavare gli organoidi con 300 microlitri di tampone anticolorante e metterli su uno shaker per cinque minuti.
Quindi permeabilizzare l'organoide aggiungendo delicatamente 300 microlitri di tampone di permeabilizzazione. Dopo 20 minuti di incubazione, rimuovere il tampone e lavare con 300 microlitri di tampone colorante. Posizionare gli organoidi su uno shaker per cinque minuti.
Quindi, aggiungere 300 microlitri di tampone colorante per bloccare la fase di permeabilizzazione. Posizionare sullo shaker per 30 minuti e aspirare il tampone anticolorante con una pipetta. Quindi aggiungere 300 microlitri di anticorpi primari diluiti in tampone colorante.
Incubare a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale primaria. Eseguire tre lavaggi con 300 microlitri di tampone anticolorante per cinque minuti ciascuno sullo shaker.
Aggiungere 300 microlitri di soluzione anticorpale secondaria diluita in tampone colorante e incubare per un'ora al buio. Dopo un'ora, aspirare la soluzione anticorpale secondaria e aggiungere 300 microlitri di DAPI diluito. Mettere sullo shaker per cinque minuti.
Eseguire tre lavaggi con 300 microlitri di tampone anticolorante per cinque minuti ciascuno sullo shaker. Rimuovere il tampone anticolorante e staccare le camere utilizzando il kit di rimozione fornito con le guide della camera. Tagliare la punta di una punta di pipetta P200 e utilizzarla per aggiungere un mezzo di montaggio per coprire ciascun pozzetto contenente una linguetta organoide.
Posizionare una linguetta di copertura sul campione evitando le bolle. Prendi lo smalto trasparente e dipingilo sui lati del vetro di copertura per sigillare il vetrino. Lasciare indurire per un'ora e poi posizionarlo a 20 gradi Celsius.
Acquisisci immagini utilizzando un microscopio confocale utilizzando un obiettivo 63X con olio ad immersione. Utilizzando questo protocollo, gli organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente sono stati colorati per le proteine di riparazione del danno al DNA prima e dopo l'irradiazione e valutati per biomarcatori come gamma H2AX, un marker di danno al DNA, e RAD51, un marker per la riparazione della ricombinazione omologa. Anche RPA, un marker dello stress di replicazione, 53BP1, un marker di ingiunzione non omologa, e Geminin, un marcatore del ciclo cellulare di fase GS2 sono stati valutati utilizzando questa tecnica.
Le linguette BME tendono a depolimerizzare, quindi prestare molta attenzione dopo il fissaggio e l'aspirazione è vitale. L'analisi degli antigeni per determinare il danno agli organoidi e la capacità di montare una risposta al danno del DNA potrebbe aiutare nella valutazione della resistenza chemioterapica.
