Lo studio è stato finanziato dai numeri di sovvenzione: NCI P30 CA023108 e NCI U54 CA151662.

Il Dartmouth College Animal Care and Use Program è accreditato dall'American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care (iAAALAC) e aderisce a tutte le linee guida e i regolamenti UDSA e NIH (Office of Laboratory Animal Welfare). Tutti gli studi in vivo sono stati approvati dal Dartmouth College Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). La procedura di eutanasia aderisce alle linee guida AVMA 2020 per l'eutanasia degli animali.
1. Strumentazione/progettazione del sistema
<ol><li>Progetta un'antenna AMF personalizzata (bobina) per essere un anello chiuso, scegliendo le forme per creare il campo magnetico desiderato. Utilizzare le formule e le caratteristiche di induttanza dalla scelta del generatore di potenza per progettare bobine compatibili per generare il campo desiderato. Utilizzare diversi design per esperimenti in vitro e in vivo.</li>
	<li>Assicurarsi che l'induttanza dell'antenna AMF rientri nell'intervallo accettabile del generatore di corrente. Aggiungere o sottrarre condensatori per abbinare (sintonizzare) l'antenna al generatore di energia.</li>
	<li>Per gli esperimenti in vitro, progettare una bobina elicoidale a 14 giri, diametro interno 2 cm e lunghezza 14 cm, che può contenere tubi da 1,5 ml, consentendo il trattamento di più campioni contemporaneamente. Isolare la bobina con un polimero vinilico e utilizzare un distanziatore in polistirolo per separare la bobina dai tubi. I dettagli delle specifiche di progettazione e le considerazioni sono presenti nel file supplementare 1.</li>
	<li>Per gli esperimenti in vivo, acquista una bobina elicoidale per tutto il corpo costruita su misura da un produttore con informazioni di progettazione proprietarie. Utilizzare tubi quadrati da 8 mm (poiché crea un campo più uniforme all'interno del foro della bobina) e un concentratore nell'area di trattamento mirata. Rendere il concentratore lungo 5,0 cm, con un totale di 5 giri per ottenere un diametro interno di 3,6 cm, diametro esterno di 5,2 cm e avere la sua posizione nell'area di trattamento mirata. Circondare la bobina con un guscio in policarbonato.</li>
	<li>Utilizzare un generatore AMF con potenza e frequenza regolabili, nominale a 10 kW o superiore come fonte di alimentazione. L'induttanza abbina la fonte di alimentazione e le antenne/bobine a un intervallo da 0,62 a 1,18 μHenries (μH), consentendo frequenze comprese tra 30-300 kHz. Raffreddare il generatore utilizzando acqua riciclata attraverso una pompa centrifuga, pressione regolata a 50 psi.</li>
	<li>Raffreddare le bobine con un refrigeratore da 5,6 tonnellate di capacità di raffreddamento che pompa il 25% di fluido termovettore a base di glicole etilenico diluito con acqua attraverso l'antenna AMF. Impostare la temperatura del refrigeratore in modo tale che l'antenna non riscaldi o raffreddi il campione.</li>
	<li>Per il contenimento degli animali, costruire un supporto tubolare che può essere sospeso al centro della bobina con un traferro di 0,5 cm tra il supporto e la superficie della bobina. Collegare una pompa dell'aria condizionata regolabile che fa circolare l'aria attraverso il guscio attorno alla bobina e impostarla per mantenere una normale temperatura interna animale. Collegare la macchina per anestesia al supporto tubolare dell'animale vicino alla testa dell'animale per garantire la corretta erogazione dell'anestesia.</li>
	<li>Per il contenimento delle cellule, creare un apparato che faccia circolare l'acqua da un bagno d'acqua attraverso il distanziatore in cui sono posizionati i tubi. Impostare la temperatura di questo bagnomaria in modo che i tubi siano circondati dall'acqua a 37 °C.</li>
	<li>Utilizzare sonde a fibre ottiche per monitorare le temperature all'interno del tumore, il nucleo dell'animale e l'ambiente animale o per studi in vitro, monitorando la temperatura del pellet cellulare e l'acqua che circonda i tubi.</li>
	<li>Utilizzare nanoparticelle magnetiche di ossido di ferro di dimensioni 100 nm per tutti gli esperimenti. NOTA: La concentrazione e il tasso di assorbimento specifico (SAR) sono due caratteristiche che devono essere considerate quando si scelgono le nanoparticelle, in quanto influenzano direttamente il possibile riscaldamento e la dose termica18.</li>
</ol>2. Ipertermia in vitro
<ol><li>Coltura B16F10 cellule di melanoma murino in terreni RPMI con 10% FBS e 1% Pen/streptococco. Piastra 150.000 celle/pozzetto in piastre a 6 pozzetti, con 2 ml di mezzo completo.</li>
	<li>Determinare il trattamento appropriato per ogni pozzetto, cioè cellule senza mNP e senza AMF, cellule con mNP e senza AMF, cellule senza mNP e AMF, cellule con mNP e AMF. NOTA: Inoltre, assicurarsi che ci siano controlli appropriati se si combina l'ipertermia con un'altra terapia. L'AMF viene eseguito in un laboratorio di ricerca standard adattato con le capacità di alimentazione e raffreddamento necessarie.</li>
	<li>24 ore dopo la placcatura, aggiungere mNP ai pozzetti appropriati come determinato nella fase precedente. Aggiungere mNPs ad una concentrazione di 3 mg di ferro/ml. Assicurarsi che gli mNP siano distribuiti in tutto il pozzo, creando una soluzione di supporti / mNP (rimuovendo i vecchi supporti, aggiungendo questa soluzione) o aggiungendo direttamente gli mNP e ruotando delicatamente le piastre per una distribuzione omogenea.</li>
	<li>Iniziare il trattamento, 48 ore dopo l'aggiunta di mNP, quando i pozzetti sono ~ 80% confluenti, rimuovendo i mezzi e lavando i pozzetti con mezzi freschi. Rimuovere il supporto.</li>
	<li>Aggiungere 0,5 ml di tripsina a ciascun pozzetto trattato e ruotare delicatamente. Utilizzare un microscopio per verificare che le cellule siano staccate.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di supporto a ciascun pozzetto per raccogliere le cellule in tubi da 1,5 ml. Raccogliere tutte le celle dal pozzo (~1 x 106 celle). Utilizzare un tubo separato chiaramente etichettato per ciascun pozzetto.</li>
	<li>Spingere i tubi a 60 x g per 2-3 minuti per consentire alle celle di pellettare. Trattenere il pellet nel supporto.</li>
	<li>Posizionare i tubi nel distanziatore pieno d'acqua all'interno della bobina. Impostare la temperatura del bagno d'acqua in modo tale che il fluido e il pellet cellulare siano mantenuti a 37 °C. Monitorare la temperatura all'interno del tubo e del bagno d'acqua utilizzando sonde di temperatura a fibre ottiche separate.</li>
	<li>Accendere il refrigeratore, controllare che il refrigerante scorra attraverso la bobina. Accendere la fonte di alimentazione e regolare la percentuale massima in base al campo desiderato. Azionare l'elettrobobina a 14 giri, alimentata da un generatore da 10 kW, a 165 kHz e 23,87 kA/m (300 Oe).</li>
	<li>Posizionare una sonda di temperatura in fibra ottica separata in uno dei tubi. Trattare le cellule fino alla dose termica del protocollo precedentemente determinata. Un esempio è 30 min a 43 °C (CEM43 di 30).</li>
	<li>Risospendere le celle nel mezzo che si trova nei loro tubi e ri-placcare in nuove piastre a 6 pozzetti. Etichettare chiaramente i nuovi piatti. L'obiettivo è quello di ri-placcare tutte le cellule raccolte (~1 x 106 celle). NOTA: Dovrebbero essere utilizzate nuove piastre a 6 pozzetti per garantire che le cellule coltivate ricevano il trattamento. Se vengono utilizzate le vecchie piastre, potrebbero essere ancora rimaste cellule sulle piastre che non sono state tripsinizzate con successo.</li>
	<li>Se necessario, per la successiva procedura sperimentale, lisare le cellule per l'analisi dell'espressione di RNA o proteine.</li>
</ol>3. Ipertermia in vivo
<ol><li>Coltura cellulare e inoculazione<ol><li>Coltura B16F10 cellule di melanoma murino in terreni RPMI con 10% FBS e 1% Pen/streptococco. Utilizzare piastre / piatti che forniscano abbastanza cellule per l'inoculazione del numero desiderato di animali. Ad esempio, piatti da 10.100 mm, placcati a 100.000 cellule saranno confluenti con abbastanza cellule per 20 iniezioni di topi entro 48 ore.</li>
		<li>Tripsinizzare le cellule e raccogliere utilizzando supporti RPMI puri (senza FBS o penna / streptococco).</li>
		<li>Contare le cellule e creare una soluzione per la concentrazione desiderata di cellule, in base al volume di inoculazione e al numero di mouse.</li>
		<li>Anestetizzare topi femmina C57Bl/6 di 6 settimane usando isoflurano vaporizzato e ossigeno. Mettere gli animali in una scatola di plexiglass con il 5% di isoflurano e il 95% di ossigeno fino a quando non vengono indotti. Una volta indotto, rimuovere l'animale e usare un cono facciale al 2% di isoflurano per completare i passaggi 3.1.5-3.1.7 e 3.3.3-3.3.6. NOTA: Per l'anestesia durante il trattamento utilizzare un contenimento dell'anestesia incorporato. Seguire i protocolli istituzionali standard per l'anestesia del topo. Prima della sperimentazione animale garantire l'approvazione IACUC appropriata. Dopo l'anestesia, riportare l'animale in gabbia e monitorare il recupero per garantire che non ci siano complicazioni.</li>
		<li>Controlla la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento.</li>
		<li>Rasare il fianco destro usando un rasoio elettrico.</li>
		<li>Pulire l'area di iniezione con una salvietta imbevuta di alcool. Iniettare 1-2 x 106 cellule, utilizzando una siringa di vetro da 100 μL con un ago da 28 G, dispersa in 50 μL di terreno per via intradermica sul fianco destro rasato di anestetizzato.</li>
	</ol></li>
	<li>Crescita tumorale/iniezione di nanoparticelle<ol><li>Misura i tumori in 3 dimensioni usando i calibri (lunghezza, larghezza e profondità) e calcola i volumi per (lunghezza x larghezza x profondità x π)/6.</li>
		<li>Quando i volumi tumorali raggiungono 120 mm 3 (+/- 20 mm3), mettere gli animali in studio. Progettare lo studio, assicurandosi che ci siano gruppi di controllo e trattamento appropriati che includano coorti di terapia combinata (cioè controllo, mNPH, radiazioni e la combinazione).</li>
		<li>Anestetizzare i topi che riceveranno mNP come descritto al punto 3.1.4.</li>
		<li>Pulire l'area con una salvietta imbevuta di alcool. Iniettare mNPs nel tumore 3 ore prima del trattamento con AMF. Iniettare un volume tale che la dose sia di 7,5 mg di ferro/cm3 di tumore. NOTA: Dati non pubblicati dal laboratorio suggeriscono che l'assorbimento massimo di mNP avviene a 3-6 ore.</li>
	</ol></li>
	<li>Trattamento AMF<ol><li>Anestetizzare il mouse e posizionarlo su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura interna.</li>
		<li>Controlla la mancanza di risposta ai riflessi di raddrizzamento. Rimuovere il marchio auricolare o altri oggetti metallici sul mouse.</li>
		<li>Posizionare delicatamente una sonda di temperatura in fibra ottica lubrificata nel retto del mouse.</li>
		<li>Posizionare un catetere nel tumore, rimuovendo l'ago. Tagliare il catetere in modo tale che non sporga troppo dal tumore. NOTA: I cateteri di temperatura a fibre ottiche vengono posizionati e rimossi mentre i topi sono in anestesia generale, cioè i cateteri sono in posizione solo durante la procedura di riscaldamento del tumore. Ai topi viene somministrata una singola dose sottocutanea di un farmaco per l'analgesia dei FANS, ketoprofene (5 mg / kg), al momento della procedura. Non abbiamo osservato disagio o morbilità a breve o lungo termine associati al posizionamento dei cateteri.</li>
		<li>Inserire una sonda di temperatura a fibra ottica a 3 sensori nel catetere. Il catetere protegge i sensori della sonda di temperatura in fibra ottica.</li>
		<li>Fissare la sonda rettale e intratumorale alla coda dell'animale per assicurarsi che rimangano in posizione.</li>
		<li>Posizionare il mouse in un tubo da 50 ml, dirigersi verso il basso. Il tubo dovrebbe avere un foro vicino alla testa dove l'anestesia sarà collegata e consegnata.</li>
		<li>Posizionare il tubo all'interno della bobina e ricollegare l'anestesia.</li>
		<li>Posizionare una sonda di temperatura in fibra ottica liberamente nel tubo per misurare la temperatura ambiente.</li>
		<li>Accendere il refrigeratore e assicurarsi che il refrigerante sia in circolazione.</li>
		<li>Controllare e assicurarsi che il software del computer visualizzi le varie temperature e iniziare la registrazione per consentire la visualizzazione di un calcolo CEM43 in tempo reale. Il CEM43 richiesto è la dose precedentemente determinata. NOTA: Prima di accendere il magnete, assicurarsi che nessun oggetto metallico sia attaccato all'animale, poiché questi si riscaldano rapidamente. Inoltre, assicurati che tutti nella stanza non abbiano un pacemaker e che sia sicuro per loro essere lì.</li>
		<li>Accendere il magnete a bassa percentuale di potenza.</li>
		<li>Assicurarsi che le sonde di temperatura in fibra ottica registrino le variazioni di temperatura. Le temperature aumenteranno una volta attivato l'AMF all'aumentare del campo. Assicurarsi che la temperatura interna dell'animale rimanga a 38 °C. Regolare la temperatura interna utilizzando la camicia ad aria condizionata.</li>
		<li>Regolare la forza del campo magnetico cambiando l'alimentazione sul generatore, utilizzando il quadrante di controllo incorporato, che a sua volta controlla il livello di temperatura nel tumore.</li>
		<li>Spegnere l'AMF una volta che la dose desiderata, come precedentemente determinato dall'utente (ad esempio CEM43 40), è stata raggiunta all'interno del tumore.</li>
		<li>Una volta spento l'AMF, rimuovere il tubo dalla bobina.</li>
		<li>Rimuovere il mouse dal tubo, estraendo le varie sonde e catetere. Se necessario, etichettare l'animale con un nuovo marchio auricolare metallico.</li>
		<li>Una volta completati i trattamenti, spegnere il refrigeratore.</li>
		<li>Recuperare gli animali dall'anestesia garantendo l'assenza di complicazioni. Monitorare il loro comportamento per garantire il ritorno alla normalità.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La progettazione e l'implementazione di questo sistema fornisce la capacità di condurre esperimenti accurati e riproducibili in vitro e in vivo di ipertermia di nanoparticelle magnetiche. È fondamentale che il sistema sia progettato in modo tale che la frequenza AMF e l'intensità del campo siano adeguatamente abbinate al tipo di nanoparticelle magnetiche, alla concentrazione, alla posizione e alla temperatura del tessuto desiderate. Inoltre, il monitoraggio accurato della temperatura in tempo reale è fondamentale per...

L'ipertermia è stata storicamente utilizzata nella terapia del cancro, da sola o in combinazione con altri trattamenti. Sebbene abbia una lunga storia di utilizzo, il metodo più vantaggioso per fornire questo trattamento è ancora in discussione e dipende dal sito e dalla posizione della malattia. I metodi per la somministrazione di ipertermia includono microonde, radiofrequenza, ultrasuoni focalizzati, laser e nanoparticelle metalliche (come oro o ossido di ferro)1,2,3,4. Questi metodi di somministrazione possono portare a una gamma di temperature di trattamento dal livello di febbre fino a centinaia di gradi C. L'effetto biologico dell'ipertermia dipende principalmente dalle temperature utilizzate e dalla durata del trattamento5. Per questo manoscritto e scopo, ci stiamo concentrando sull'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche (mNPH). Questo metodo consente variazioni di temperatura focalizzate, localizzate, ben monitorate e controllate, utilizzando nanoparticelle di ossido di ferro non tossiche, approvate dalla FDA.
Una trappola di altre modalità di ipertermia è la mancanza di un preciso targeting cellulare; L'ipertermia non ha un rapporto terapeutico intrinsecamente elevato, pertanto è necessaria un'attenta termometria e targeting6. mNPH consente l'iniezione sistemica o intratumorale di mNP, con il calore generato solo dove si trovano gli mNP, indirizzando così il trattamento direttamente al tumore. mNPH può essere efficace quando le nanoparticelle magnetiche si trovano all'interno o all'esterno della cellula. Per la terapia del cancro, la panoramica generale di mNPH è che le nanoparticelle magnetiche vengono iniettate (per via intratumorale o endovenosa), quindi viene applicato un campo magnetico alternato, causando il costante riallineamento dei poli magnetici delle nanoparticelle, portando ad un riscaldamento localizzato delle cellule e dei tessuti associati alle nanoparticelle 7,8 . Regolando il volume delle nanoparticelle e la frequenza/forza del campo magnetico alternato (AMF), è possibile controllare attentamente la temperatura generata all'interno del tessuto.
Questo trattamento funziona bene nei tumori che si trovano vicino alla superficie corporea, poiché i tumori più profondi richiedono AMF più forte, quindi il rischio di riscaldamento a correnti parassite aumenta9. Ci sono prove che l'ipertermia viene utilizzata clinicamente come monoterapia, tuttavia, spesso l'ipertermia è combinata con radioterapia o chemioterapia, portando ad un effetto anti-cancro più mirato10,11,12. L'evidenza clinica dell'ipertermia che funziona in combinazione con la radioterapia è stata esaminata in una precedente pubblicazione13. Il nostro laboratorio ha trattato con successo una varietà di animali, dai topi ai maiali e tumori canini spontanei, utilizzando il metodo mNPH12,14,15. Questo protocollo è progettato per coloro che sono interessati a studiare gli effetti del trattamento di ipertermia localizzata, da solo o in combinazione con altre terapie.
Uno dei fattori più importanti nell'ipertermia è essere in grado di misurare e comprendere, in tempo reale, la dose termica erogata al tessuto bersaglio/tumorale. Un metodo standard per calcolare e confrontare la dose consiste nella dimostrazione dei minuti equivalenti cumulativi di riscaldamento a 43 °C; Questo algoritmo consente di confrontare le dosi indipendentemente dal sistema di erogazione, le temperature massime e minime (all'interno di un intervallo specifico) e i parametri di riscaldamento/raffreddamento 5,16. Il calcolo CEM funziona meglio per temperature comprese tra 39-57 °C5. Ad esempio, in alcuni degli studi che abbiamo eseguito, abbiamo scelto una dose termica di CEM43 30 (cioè 30 minuti a 43 °C). La scelta di questa dose ci ha permesso di esaminare un sicuro, efficace, effetti immunogenetici in vitro, sia da solo, sia in combinazione con una singola dose di radiazioni17.
Con l'ipertermia magnetica a nanoparticelle, ci sono diversi fattori che devono essere considerati nella costruzione di un sistema di consegna appropriato. La progettazione della strumentazione include importanti fattori di sicurezza, come l'uso di un refrigeratore per garantire che l'apparecchiatura di erogazione del campo magnetico rimanga fredda anche quando funziona ad alta potenza e procedure fail-safe che impediscono l'accensione del sistema se tutti i sistemi di temperatura, valutazione della potenza e controllo non sono stati attivati. Inoltre, ci sono importanti fattori biologici che devono essere considerati sia in situazioni in vivo che in vitro. Quando si utilizzano cellule in coltura, è necessario trattare nei terreni di crescita e mantenere una temperatura vitale costante per evitare cambiamenti fisiologici che potrebbero influenzare i risultati. Per i singoli tipi di nanoparticelle, è importante conoscere il tasso di assorbimento specifico (SAR) quando si calcolano i parametri di riscaldamento basati su AMF. Allo stesso modo, è importante conoscere la concentrazione di mNP/Fe, nelle cellule e nei tessuti, necessaria per ottenere il riscaldamento desiderato. I metodi in vivo richiedono ancora più attenzione ai dettagli poiché l'animale deve essere mantenuto in anestesia durante il trattamento e la temperatura corporea interna dell'animale deve essere mantenuta a un livello normale durante tutto il trattamento. Permettere all'animale di abbassarsi della temperatura corporea, come avviene in anestesia, può influire sui risultati complessivi, rispetto alla dose termica del tessuto da trattare.
In questo manoscritto, discutiamo i metodi utilizzati per progettare e costruire un versatile sistema di ipertermia magnetica a nanoparticelle, nonché importanti fattori d'uso che devono essere considerati. Il sistema descritto consente la somministrazione robusta, coerente, biologicamente appropriata, sicura e ben controllata dell'ipertermia di nanoparticelle magnetiche. Infine, va notato che gli studi mNPH che conduciamo spesso coinvolgono altre terapie come radioterapia, chemioterapia e immunoterapia. Affinché questi risultati siano significativi, è importante determinare in che modo il calore erogato può influenzare l'efficacia e/o la sicurezza-tossicità di altre modalità (o viceversa) e il benessere dell'animale. Per questo motivo e per le situazioni dosimetriche e terapeutiche precedentemente menzionate, è essenziale prestare la massima attenzione all'accuratezza del dosaggio dell'ipertermia con nanoparticelle magnetiche e alle misurazioni continue della temperatura del nucleo e del target. L'obiettivo di questo protocollo è fornire un metodo e una descrizione semplici e coerenti per la somministrazione di ipertermia magnetica a nanoparticelle sicura ed efficace.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>.25% Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Eppendorf 22363204</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10 murine melanoma cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-6475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57/Bl6 mice</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>027C57BL/6</td>
			<td>6-week-old female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller</td>
			<td>Thermal Care</td>
			<td>NQ 5 series</td>
			<td>chiller that cools the coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coolant fluid</td>
			<td>Dow Chemical Company</td>
			<td>Dowtherm SR-1</td>
			<td>antenna cooling fluid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fiber optic probes, software and chassis</td>
			<td>FISO</td>
			<td></td>
			<td>FISO evolution software used to read the temperatures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td></td>
			<td>infrared camera to monitor unintentional heating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron oxide nanoparticles</td>
			<td>micromod Partikeltechnologie GmbH</td>
			<td>Bionized NanoFerrite</td>
			<td>dextran coated iron oxide nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse coil, solenoid</td>
			<td>Fluxtrol</td>
			<td>custom built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin/streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-652</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF generator</td>
			<td>Huttinger</td>
			<td>TIG 10/300</td>
			<td>power source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI media</td>
			<td>Corning</td>
			<td>45000-396</td>
			<td>available from many companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo delivery of magnetic nanoparticle hyperthermia using a custom-built delivery system

L'ipertermia è stata a lungo utilizzata nel trattamento del cancro. Le tecniche sono variate dall'inserimento intratumorale di barre di ferro calde, a nanoparticelle magnetiche mirate agli anticorpi tumorali erogate per via sistemica, a temperature da 39 ° C (livello di febbre) a 1.000 ° C (elettrocauterizzazione) e tempi di trattamento da secondi a ore. La relazione temperatura-tempo (dose termica) detta l'effetto con alte dosi termiche con conseguente ablazione tissutale e dosi termiche più basse con conseguenti effetti subletali come aumento del flusso sanguigno, accumulo di farmaci e stimolazione immunitaria. Una delle terapie mediche attuali più promettenti è l'ipertermia con nanoparticelle magnetiche (mNPH). Questa tecnica prevede l'attivazione di nanoparticelle magnetiche, che possono essere veicolate sistemicamente o intratumoralmente, con un campo magnetico alternato non invasivo e non tossico. La dimensione, la costruzione e l'associazione delle nanoparticelle magnetiche e la frequenza e l'intensità del campo magnetico sono i principali determinanti del riscaldamento. Abbiamo sviluppato strumentazione e tecniche sofisticate per fornire ipertermia magnetica riproducibile con nanoparticelle in modelli animali grandi e piccoli e cellule in coltura. Questo approccio, che utilizza il monitoraggio continuo della temperatura in tempo reale in più posizioni, consente la somministrazione di dosi termiche ben definite al tessuto bersaglio (tumore) o alle cellule, limitando al contempo il riscaldamento dei tessuti non bersaglio. Il controllo e il monitoraggio precisi della temperatura, in più siti, e l'uso dell'algoritmo standard del settore (minuti equivalenti cumulativi a 43 °C / CEM43), consente una determinazione e una quantificazione accurate della dose termica. Il nostro sistema, che consente un'ampia varietà di temperature, dosi termiche ed effetti biologici, è stato sviluppato attraverso una combinazione di acquisizioni commerciali e sviluppi interni di ingegneria e biologia. Questo sistema è stato ottimizzato in modo da consentire la rapida conversione tra tecniche ex vivo, in vitro e in vivo. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come progettare, sviluppare e implementare una tecnica e un sistema efficaci per fornire ipertermia riproducibile e accurata con terapia magnetica con nanoparticelle (mNP).

Studi in vitro Le cellule raggiungeranno e manterranno la temperatura e la dose termica desiderate solo se la quantità e la concentrazione delle nanoparticelle magnetiche / ferro e dell'AMF sono opportunamente abbinate. Quando si utilizzano nanoparticelle magnetiche per riscaldare le cellule in vitro (e in vivo), va notato che per ottenere l'ipertermia in cellule con nanoparticelle magnetiche internalizzate, sarà necessario un livello specifico di mNP / Fe intracellulare e sarà necessario il numero...

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In Vitro and In Vivo Delivery of Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using a Custom-Built Delivery System

Questo protocollo presenta le tecniche e la metodologia necessarie per la consegna accurata dell'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche utilizzando un sofisticato sistema di consegna e monitoraggio.

Somministrazione in vitro e in vivo dell'ipertermia magnetica con nanoparticelle utilizzando un sistema di consegna personalizzato

Hyperthermia has long been used in the treatment of cancer. Techniques have varied from the intra-tumoral insertion of hot iron rods, to systemically ...

in-vitro-vivo-delivery-magnetic-nanoparticle-hyperthermia-using

Research

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Medicine

4.2K Views.  Dartmouth College. Questo protocollo presenta le tecniche e la metodologia necessarie per la consegna accurata dell'ipertermia delle nanoparticelle magnetiche utilizzando un sofisticato sistema di consegna e monitoraggio.

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Cultura Vivo del tessuto del paziente e l&#39;esame di consegna Gene

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

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Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue revascularization and cell survival. In addition, further observations revealed that specific stem cells, such as cardiac stem cells, mesenchymal stem cells and cardiospheres have the ability to integrate within the surrounding myocardium by differentiating into cardiomyocytes, smooth muscle cells and endothelial cells.
Here, we present the materials and methods to reliably deliver noncontractile cells into the left ventricular wall of immunodepleted mice. The salient steps of this microsurgical procedure involve anesthesia and analgesia injection, intratracheal intubation, incision to open the chest and expose the heart and delivery of cells by a sterile 30-gauge needle and a precision microliter syringe.
Tissue processing consisting of heart harvesting, embedding, sectioning and histological staining showed that intramyocardial cell injection produced a small damage in the epicardial area, as well as in the ventricular wall. Noncontractile cells were retained into the myocardial wall of immunocompromised mice and were surrounded by a layer of fibrotic tissue, likely to protect from cardiac pressure and mechanical load.

Intramyocardial cell delivery in murine models of cardiovascular diseases, such as hypertension or myocardial infarction, is widely used to test the therapeutic potential of different cell types in regenerative studies. Therefore, a detailed description and a clear visualization of this surgical procedure will help to define the limits and advantages of cardiovascular cell therapeutic analyses in small rodents.

Intramiocardico cellulare di consegna: Osservazioni in murini Hearts

Previous studies showed that cell delivery promotes cardiac function amelioration by release of cytokines and factors that increase cardiac tissue ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

Lento rilascio Drug Delivery attraverso Elvax 40W al Rat Retina: Implicazioni per il trattamento di condizioni croniche

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

L&#39;esaurimento delle cellule di topo da xenotrapianti tumorali umani migliora in modo significativo Analisi A valle delle cellule bersaglio

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Intravascular Delivery of Biologics to the Rat Kidney

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage Renal Disease with high risk of death for cardiovascular events. Moreover, recent clinical studies have shown that renovascular structure and function may have a great impact on functional renal recovery after surgery. Here, we describe a protocol for the delivery of drugs into the renal artery of rats. This procedure offers significant advantages over the frequently used systemic administration as it may allow a more localized therapeutic effect. In addition, the use of rodents in pharmacodynamic analysis of preclinical studies may be cost effective, paving the way for the design of translational experiments in larger animal models. Using this technique, infusion of rat recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) protein in rats has induced activation of VEGF signaling as shown by increased expression of FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. In summary, we established a protocol for the intrarenal delivery of drugs in rats, which is simple and highly reproducible.

The administration of drugs for recovery of kidney function requires control of the localization and distribution of the therapeutic compound. Here, we describe in detail a simple technique for intrarenal delivery of drugs in rats. This procedure may be easily performed with no mortality and high reproducibility.

Consegna intravascolare di Biologics al rene di ratto

The renal microvascular compartment plays an important role in the progression of kidney disease and hypertension, leading to the development of End Stage ...

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling molecules that affect multiple organs; they modulate gut motility and hormone production, and alter vascular tone, glucose metabolism, lipid metabolism, and energy utilization. Changes in fecal bile acids may alter the gut microbiome and promote colon pathology including cholerrheic diarrhea and colon cancer. Key regulators of fecal bile acid composition are the small intestinal Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter (ASBT) and fibroblast growth factor-19 (FGF19). Reduced expression and function of ASBT decreases intestinal bile acid up-take. Moreover, in vitro data suggest that some FDA-approved drugs inhibit ASBT function. Deficient FGF19 release increases hepatic bile acid synthesis and release into the intestines to levels that overwhelm ASBT. Either ASBT dysfunction or FGF19 deficiency increases fecal bile acids and may cause chronic diarrhea and promote colon neoplasia. Regrettably, tools to measure bile acid malabsorption and the actions of drugs on bile acid transport in vivo are limited. To understand the complex actions of bile acids, techniques are required that permit simultaneous monitoring of bile acids in the gut and metabolic tissues. This led us to conceive an innovative method to measure bile acid transport in live animals using a combination of proton (1H) and fluorine (19F) magnetic resonance imaging (MRI). Novel tracers for fluorine (19F)-based live animal MRI were created and tested, both in vitro and in vivo. Strengths of this approach include the lack of exposure to ionizing radiation and translational potential for clinical research and practice.

Using Multi-fluorinated Bile Acids and In Vivo Magnetic Resonance Imaging to Measure Bile Acid Transport

Tools to diagnose bile acid malabsorption and measure bile acid transport in vivo are limited. An innovative approach in live animals is described that utilizes combined proton (1H) plus fluorine (19F) magnetic resonance imaging; this novel methodology has translational potential to screen for bile acid malabsorption in clinical practice.

Utilizzando Multi-fluorurati biliari acidi e<em&gt; In Vivo</em&gt; Risonanza Magnetica misurare Bile Acid Trasporti

Along with their traditional role as detergents that facilitate fat absorption, emerging literature indicates that bile acids are potent signaling ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Metodo ottimizzato di LC-MS/MS per l'analisi di High-throughput di campioni clinici di Ivacaftor, suoi principali metaboliti e Lumacaftor nei fluidi biologici di pazienti affetti da fibrosi cistica

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Migliorato il metodo per la creazione di un In Vitro barriera emato - encefalica modello basato sulle cellule endoteliali Porcine cervello

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...