Questo è un protocollo video per il metodo di interferenza dell'RNA mediato dall'elettroporazione in Odonata. Libellule e damselflies, membri dell'ordine Odonata, sono tra gli insetti più ancestrali. L'odonata per adulti mostra una notevole diversità nei colori e nei modelli del corpo, e sono stati condotti molti studi ecologici e comportamentali.
Tuttavia, sono mancati studi genetici molecolari sull'Odonata, perché l'analisi funzionale genica è molto difficile. Ad esempio, il metodo RNAi convenzionale non è efficace nelle specie di Odonata. Recentemente, abbiamo stabilito un metodo RNM in combinazione con l'elettroporazione in vivo.
Qui, forniamo un protocollo video per l'RNAi mediato dall'elettroporazione sia in libellule che in damselflies. Come specie rappresentativa di damselflies usiamo il damigella dalla coda blu. Ischnura senegalensis.
Questa è una delle specie damigella più comuni e spesso si trova in stagni soleggiati in Giappone. In primo luogo, mostriamo il protocollo RNAi che prende di mira l'addome di un damigella, Ischnura senegalensis. Dopo l'anestesia ghiacciata a quel due perni su entrambi i lati del protorace e fissare la larva a un supporto fisso.
Tirare e allungare la membrana interse segmentale tra il settimo e l'ottavo segmento addominale usando le forcep. Mantenere la membrana interse segmentale tesa a mano. Inserire la punta del capillare preparato nella membrana intersegmentale allungata.
Iniettare 1 microlitro di soluzione di siRNA o dsRNA. Applicare due goccioline di gel ad ultrasuoni sulla superficie larvale usando le forcep. Posizionare gli elettrodi sul gel ad ultrasuoni, con l'elettrodo positivo sul lato dell'iniezione.
Genera impulsi di elettroporazione 10 volte utilizzando un elettroporatore. Pulire il gel rimanente sulla superficie con un tovagliolo di carta. Rimuovere i perni degli insetti e tenere le larve trattate su un tovagliolo di carta bagnato per circa un giorno per il recupero.
Successivamente, mostriamo il protocollo RNAi che prende di mira il torace di un damigella, Ischnura senegalensis. Dopo l'anestesia ghiacciata attaccare due perni su entrambi i lati del protorace e fissare la larva a un supporto fisso. Tirare e allungare la membrana intersegmentale tra il protorace e il synthorax usando la mano.
Inserire la punta del capillare preparato nella membrana intersegmentale allungata. Iniettare un microlitro di soluzione di siRNA o dsRNA. Applicare due goccioline di gel ad ultrasuoni sulla superficie della larva usando le forcep.
Posizionare gli elettrodi sul gel ad ultrasuoni, con un elettrodo positivo sul lato dell'iniezione. Genera impulsi di elettroporazione 10 volte utilizzando un elettroprolatore. Pulire il gel rimanente sulla superficie con un tovagliolo di carta.
Rimuovere i perni degli insetti e tenere le larve trattate su un tovagliolo di carta bagnato per circa un giorno per il recupero. Come specie rappresentativa di libellula usiamo la libellula skimmer Pied. Pseudotemis zonata.
Questa è una delle specie di libellula più comuni e spesso si trova in stagni ombrosi in Giappone. Infine, mostriamo il protocollo RNI che prende di mira l'addome di una libellula, Pseudothemis zonata. Allungare la membrana intersegmentale tra il quarto e il quinto segmento addominale.
Fai un piccolo buco con un ago fine tra il quarto e il quinto segmento addominale. Inserire la punta del capillare preparato nel foro preparato. Iniettare un microlitro di soluzione di siRNA o dsRNA.
Fissare la larva a un supporto fisso usando i perni. Applicare due goccioline di gel ad ultrasuoni sulla superficie larvale usando le forcep. Posizionare gli elettrodi sul gel ad ultrasuoni con l'elettrodo positivo sul lato dell'iniezione.
Genera impulsi di elettroporazione 10 volte utilizzando un elettroporatore. Pulire il gel rimanente sulla superficie con un tovagliolo di carta. Rimuovere i perni degli insetti e tenere le larve trattate su un tovagliolo di carta bagnato per circa un giorno per il recupero.
Qui abbiamo selezionato un gene di sintesi della melanina MCO2 come gene bersaglio, e EGFP o bla come bersaglio di controllo negativo. MCO2 è essenziale per la formazione di colori neri in vari insetti. Per prima cosa mostriamo i risultati nell'addome di Ischnura senegalensis.
Le punte di freccia bianche indicano le regioni di pigmentazione nera soppressa in cui l'elettrodo positivo è stato posto all'elettroporazione. L'incubazione della pigmentazione è stata osservata sia con il trattamento con siRNA che con il trattamento con dsRNA. Le dimensioni e l'ubicazione del fenotipo RNI variavano considerevolmente tra gli individui.
Senza elettroporazione non sono stati osservati fenotipi RNI, il che indica che l'elettroporazione è essenziale per l'RNI in questa specie. Successivamente, mostriamo i risultati nel torace di Ischnura senegalensis. Allo stesso modo è stata osservata l'inibizione della pigmentazione nera intorno alla regione in cui l'elettrodo positivo è stato posto durante l'elettroporazione.
Infine, mostriamo i risultati nell'addome di Pseudothemis zonata. Come previsto, il fenotipo RNI è stato rilevato intorno alla regione in cui l'elettrodo positivo è stato posto all'elettroporazione. Confermiamo che il metodo RNAi mediato dall'elettroprorazione è molto utile in Odonata.
Può indurre la soppressione dei geni locali quasi al 100% di efficienza. Almeno nell'epidermide, quando selezioniamo le fasi di sviluppo appropriate. Questo metodo ne ha diversi sul metodo CRISPR/Cas9.
Ad esempio, la regione in cui compaiono i fenotipi RNAi può essere controllata dalla posizione degli elettrodi positivi all'elettporazione e i fenotipi dell'RNA possono essere facilmente confrontati con i fenotipi di controllo fianco a fianco nello stesso individuo. Inoltre, questo metodo non richiede la microiniezione in piccole uova. Quindi è molto più facile e veloce osservare il fenotipo più velocemente del metodo CRISPR / Cas9.
Inoltre, questo metodo può essere applicato agli insetti le cui uova appena deposte sono difficili da raccogliere. Ad esempio, le femmine di Pseudothemis zonata depongono le uova durante il volo. Quindi è molto difficile raccogliere le loro uova appena deposte.
Ci aspettiamo che questo protocollo possa essere generalmente applicabile agli organismi non modello quando l'RNI convenzionale non funziona in modo efficiente.
