Il protocollo fornisce un modo semplice per studiare gli scarafaggi americani. Un parassita sanitario comune e un insetto benefico per la medicina tradizionale cinese. Aiuterà a esplorare i meccanismi molecolari di molteplici attività vitali degli scarafaggi americani abbattendo geni specifici.
Il vantaggio principale di questa tecnologia è che può abbattere i geni nello scarafaggio americano o in altri insetti simili che non sono adatti per l'editing genetico. Questa tecnologia può essere utilizzata per esplorare vari campi come la regolazione genetica ed epigenetica, il processo di sviluppo dei tessuti, la rigenerazione delle appendici, il comportamento di accoppiamento e altri lati interessanti dello scarafaggio americano. Questa tecnologia è facile da usare e versatile.
Suggeriamo di mantenere gli animali sani durante il trattamento di iniezione DSRA. Credo che i principianti possano facilmente padroneggiare questa tecnica dopo diverse sessioni di pratica. Per iniziare, separa le ninfe tratteggiate dalle oothecae con un setaccio con apertura di quattro millimetri.
Scegli la P.americana bianca appena maltata con un tubo di vetro. Metti il P.americana in contenitori nuovi e attendi lo stadio corretto per il trattamento. Nel sistema di reazione, aggiungere 10 microlitri di tampone T7 2X, 2 microlitri del T7 Express Enzyme Mix e due microgrammi di prodotto PCR.
Infine, portare il volume totale a 20 microlitri con acqua doppia distillata. Mescolare delicatamente a testa in giù manualmente e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi 70 gradi Celsius per 10 minuti. Diluire 4 microgrammi per microlitro RNasi A soluzione con acqua DEPC in un rapporto da 1 a 200.
Quindi aggiungere al sistema 1 microlitro di un'unità per microlitro RQ1 RNase Free Dnase e 1 microlitro di RNasi A diluita. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere il 10% del volume totale di acetato di sodio e tre volumi del volume totale di isopropanolo.
Mescolare delicatamente a testa in giù manualmente, quindi mettere su ghiaccio per cinque minuti e centrifugare a 13.000 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Quindi, lavare il residuo con il 75% di etanolo, con il 25% di acqua trattata CON DEPC, quindi centrifugare a 13.000 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius.
Rimuovere nuovamente il surnatante, asciugare all'aria il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi sciogliere l'RNA a doppio filamento con circa 100 microlitri di acqua DEPC e diluirlo alla concentrazione finale di 2 microgrammi per microlitro. Impostare il programma nella pompa di microiniezione per garantire che il volume di ogni iniezione sia coerente.
Quindi pulire la siringa riempiendola con acqua DEPC da 8 a 10 volte. Installare la siringa da 10 microlitri sulla micropompa di iniezione. Quindi avviare la pompa e riempire la siringa con 10 microlitri di soluzione di RNA a doppio filamento.
Anestetizzare gli scarafaggi con anidride carbonica, quindi raccoglierli delicatamente con una pinzetta e consegnare lo scarafaggio verso l'ago a mano. Quindi, inserire l'ago attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide. Iniettare la soluzione di RNA a doppio filamento nello scarafaggio assicurandosi che la punta dell'ago sia il più vicino possibile all'epidermide per evitare di danneggiare gli organi interni.
Infine, estrarre la punta dell'ago. Metti gli scarafaggi iniettati in contenitori puliti per il biodosaggio. Attendere circa 10-20 minuti per farli recuperare dagli effetti dell'anidride carbonica.
Etichettare i contenitori con la data di iniezione, il tipo e la dose di RNA a doppio filamento e l'età del P.americana. I geni Ddc o DOPA decarbossilasi e Dpp o decapentaplegici sono stati selezionati come due esempi per osservare il fenotipo degli scarafaggi maltati dopo l'iniezione di RNA a doppio filamento e dsMocK che non ha bersaglio negli animali è stato preso come controllo negativo. L'efficienza RNAi è stata rilevata dalla pcr qRT.
I geni sono stati significativamente abbattuti con un valore P inferiore a 0,01 per dsDdc e inferiore a 0,05 per dsDpp. P.americana con geni Ddc knockdown aveva l'epidermide bianca a causa della melanizzazione bloccata. Nell'esperimento con iniezioni di dsDpp, l'RNAi ha interrotto la rigenerazione degli arti.
Gli insetti dovrebbero essere sani e iniettati senza danni. Questa tecnologia fornisce un modo semplice per esplorare le funzioni geniche per gli insetti che non possono essere modificati geneticamente come lo scarafaggio americano.
