La decomposizione del tessuto adiposo in sottotipi è stata impegnativa perché la natura fragile dell'adipocite. Questo protocollo è stato sviluppato per superare questo problema con un efficace isolamento di singoli nuclei. Questo flusso di lavoro fornisce nuclei singoli altamente purificati con aggregati nucleari e detriti cellulari ridotti al minimo.
Questo è vantaggioso per la profilazione del trascritoma a cella singola di migliaia di cellule. Questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l'organizzazione a livello tissutale dell'adipocite nelle loro cellule residenti adipose. E in particolare, allo sviluppo fenotipizzazione, knockout adiposo e topi transgenici.
La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale in modo che le persone che non hanno molta esperienza nella gestione dell'adipocite possano replicarsi e comprendere l'eterogeneità degli adiposi. Dopo aver raccolto il tessuto adiposo dai topi, asciugarlo con un tovagliolo di carta e posizionare in un piatto pulito. Aggiungere cloruro di calcio al tampone di digestione a una concentrazione finale di 10 mM.
Quindi, aggiungere un piccolo volume al tessuto e tritarlo accuratamente. Aggiungere circa la metà della quantità di tampone di digestione preparato al tessuto tritato. E utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il campione in un tubo di centrifuga da 50 ml.
Lavare il piatto con il tampone rimanente e aggiungerlo al tubo da 50 ml. Pipettare il campione su e giù più volte. Quindi, incubarlo per 12-15 minuti a 37 gradi Celsius mentre trema a 200-210 giri/min.
Dopo l'incubazione, aggiungere lo 0,5%BSA al campione con un rapporto volume 1 a 1 e mescolare bene con la pipettazione. Centrifugare il campione a 300 xg per cinque minuti a temperatura ambiente per far girare verso il basso la frazione stromovascolare lasciando la frazione adipocite in cima. Filtrare la frazione superiore attraverso un filtro cellulare da 400 m in un tubo da 50 ml.
Quindi capovolgere il filtro sul tubo e trasferire gli adipociti su un nuovo tubo utilizzando lo 0,5%BSA per lavare in retromarcia il filtro. Portare il volume totale della BSA a 10-15 mL e pipettare il campione su e giù con pipetta sierologica. Quindi, centrifugarlo di nuovo a 300 xg per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo la centrifugazione, utilizzare una punta di pipetta ad ampio foro per trasferire con cura lo strato superiore del campione in un filtro cellulare da 100 m sopra un nuovo tubo pre-refrigerato su ghiaccio. Risciacquare il filtro con una quantità sufficiente di tampone di preparazione dei nuclei, quindi scartarlo. Da questo passo avanti, tieni un campione sul ghiaccio e lavora rapidamente.
Lasciare il campione sul ghiaccio per un massimo di due minuti invertendo a intermittenza il tubo per mescolare. Quindi, centrifuga a 1000 xg e 4 gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet in 1 mL di tampone di preparazione dei nuclei.
Trasferire il campione su un tubo di microcentrifugo pulito, occupandosi di evitare di toccare le pareti del vecchio tubo. Aggiungere 0,6 unità per inibitore della RNasi L e mescolarlo. Quindi, centrifugare il campione per altri 10 minuti.
Rimuovere il supernatante e rimescolare un pellet e 1 mL di tampone di lavaggio dei nuclei. Filtrare due volte il campione in un tubo pulito utilizzando filtri impilabili da 30 m. Quindi, lavare i filtri con circa 300 L di tampone di lavaggio dei nuclei.
Per confermare il corretto isolamento dei nuclei sani, macchiare una piccola aliquota del campione con trypan e utilizzare un contatore di celle automatizzato per valutare la dimensione media dei morti e la percentuale di cellule morte. Macchiare una piccola aliquota del campione con DAPI ed esaminarla al microscopio con un obiettivo 20X o superiore. I nuclei dovrebbero essere rotondi e avere una membrana nucleare intatta.
Le frecce bianche indicano nuclei senza membrana intatta. Dopo aver ripulito i nuclei con FACS, concentrare questo campione centrifugando a 500 xg per cinque minuti a 4 gradi Celsius. Quindi, ricostituirlo in un volume appropriato di tampone di lavaggio dei nuclei.
Per ottenere una concentrazione da 50 a 1500 nuclei per L e procedere con nuclei monochirro RNA seq. Per rimuovere detriti cellulari e farsa, i nuclei adipocite vengono ordinati per dimensioni e granularità per escludere aggregati e multipli nucleari. E infine per gli eventi positivi DAPI.
Questa strategia di classificazione si traducono in nuclei singoli altamente purificati con aggregati e detriti minimi. Se ispezionati per microscopia, i nuclei ordinati devono essere rotondi e avere una membrana intatta. Una corretta purificazione dei nuclei può anche essere eseguita con qRT-PCR in tempo reale usando primer per il nascente mRNA Ucp1, un gene marcatore per gli adipociti marroni.
La piattaforma del cromo determinò un trascrittame di 7500 nuclei dal tessuto adiposo bruno interscapulare murino. Sette diversi tipi di cellule sono stati rivelati con riduzione della dimensionalità t-SNE e clustering k-means. Tutti gli ammassi espressero Fabp4, un gene pan adipocite e un sottoinsieme espressero un alto livello di mRNA Ucp1.
Nuclei isolati e poi confermati anche se questo protocollo può essere sottoposto praticamente a qualsiasi piattaforma di espressione genica a livello di singola cellula, incluso il cromo della genomica 10x.
