Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come come vengono attivati i globuli bianchi e come si sviluppano le allergie ai singoli allergeni? Il vantaggio principale di questo modello di topo allergico robusto e riproducibile è che un minor numero di topi può essere utilizzato per produrre una minore varianza con una popolazione sperimentale. Le nuove immunoterapie per controllare le risposte immunitarie richiedono modelli di topo robusti come mezzo iniziale per testare l'efficacia in vivo.
Pertanto, le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'immunoterapia allergica. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle allergie, può anche essere applicato ad altri sistemi, come l'autoimmunità in cui le risposte anticorpali indesiderate svolgono un ruolo chiave nella malattia. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa della mancanza di esperienza nel lavorare con nanoparticelle liposomiche o di un'inesperienza con le tecniche richieste nel lavoro del topo.
Iniziare aggiungendo 2,5 equivalente molare del reticolazione eterobifunzionale alla proteina e posizionando la reazione su uno shaker oscillante a temperatura ambiente per circa un'ora. Dopo un'incubazione di un'ora con SPDP, desalt la proteina su una colonna equilibrata in acetato di sodio 100 millimolare e raccogliere le frazioni. Determinare l'assorbanza di 280 nanometri e mettere in comune le frazioni migliori.
Lavare la colonna in PBS e aggiungere ditiotriolo 25 millimolare, o DTT, alle frazioni proteiche raggruppate per un'incubazione da cinque a 10 minuti. Quindi, misurare le assorbanza di 280 e 343 nanometri della proteina per consentire il calcolo del rapporto di collegamento in base alla molarità della proteina e del linker. Successivamente, eseguire le frazioni raggruppate della colonna lavata con PBS e raccogliere le frazioni per la misurazione del pooling di 280 nanometri e frazione superiore come dimostrato.
Aggiungere il volume appropriato di 100x DSPE-PEG2000-Maleimide alla proteina per ottenere una concentrazione finale in eccesso molare 1x, 10 volte con un delicato vorticoso. Quindi, eseguire la reazione durante la notte sotto azoto in un pallone rotondo-fondo sigillato. Il giorno seguente, eseguire la proteina su una colonna di perline di gel di dextran reticate e conservare le frazioni finali raggruppate di proteine lipidiche a quattro gradi Celsius fino al loro uso.
Una volta calcolata la corretta quantità di ciascun lipide, combinare tutti i lipidi in una provetta di vetro borosilicato da 12 millilitri e utilizzare una siringa e tubi da tre millilitri per soffiare con cura il cloroformio con azoto. Quindi, liofilizzare la soluzione con 100 microlitri di DMSO durante la notte. La mattina seguente, aggiungere un millilitro di proteine lipidiche collegate al tubo lipidico da 12 millilitri e sonicare la soluzione da tre a quattro volte per 30-60 secondi per sonicazione in un bagno d'acqua di sonicazione con almeno cinque minuti di riposo tra le sonicazioni.
Dopo l'ultima sonicazione, caricare il campione in una delle siringhe estrusorie poste nell'estrusore e posizionare la siringa estrusore nell'altra estremità dell'estrusore. La siringa vuota si riempirà quando il lipide viene estruso attraverso la membrana policarbonato da 0,8 micrometri. Posizionare l'estrusore completamente assemblato in un blocco riscaldante e deprimere delicatamente lo stantuffo per svuotare la siringa.
Dopo l'ultima estrusione, trasferire i liposomi in una fiala pulita ed estrudere i lipidi attraverso membrane policarbonate 0,2 e 0,1 micrometri come appena dimostrato. Quindi, conservare i liposomi a quattro gradi Celsius. Per monitorare la risposta delle cellule B all'attivazione del liposoma antigenico, resuspend 1,5 per 10 al settimo splenociti nel tampone di carico del flusso di calcio e aggiungere 1,5-micromolare Indo-1 alle cellule, invertendo la soluzione nel tubo più volte per mescolare.
Dopo un'incubazione di bagno d'acqua di 30 minuti a 37 gradi Celsius, protetta dalla luce, aggiungere cinque volte il volume del tampone di carico del flusso di calcio e centrifugare le cellule etichettate Indo-1. Per la gating a cellule B, le cellule di macchia con anticorpo anti-CD5 e anti-B220 in 0,5 millilitri di tampone di carico a quattro gradi Celsius per 20 minuti, protette dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule in tampone di carico del flusso di calcio fresco e rimorsire il pellet da una a due volte 10 alla settima cellule per millilitro di tampone di flusso di calcio fresco per lo stoccaggio sul ghiaccio, protetto dalla luce fino all'analisi.
Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di cellule a un tubo di polistirolo chiuso, cinque millilitro, fondo rotondo e riscaldare le cellule a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Dopo tre o cinque minuti, trasferire il tubo in una camera con giacca d'acqua Celsius di 37 gradi collegata a un bagno d'acqua ricircolante e far scorrere il tubo nella giacca ad acqua sul citometro a flusso. Dopo aver raccolto da 5.000 a 10.000 eventi al secondo, consentire alle celle di stabilizzarsi per 15-30 secondi e reinizializzare l'acquisizione dei dati, raccogliendo i dati per almeno 10 secondi per stabilire una lettura in background.
Al segno di 10 secondi, rimuovere rapidamente il tubo dal citometro di flusso e aggiungere l'appropriata concentrazione sperimentale di liposomi antigenici. Quindi, pulsare le cellule e leggere il tubo sul citometro per altri tre o cinque minuti. Per sensibilizzare gli animali, consegnare 200 microlitri di estratto di arachidi contenente tossina colera tramite gavage orale a ciascuna ricevente di topo femmina BALB/c di quattro o cinque settimane una volta alla settimana per tre settimane e 300 microlitri di estratto diluito di arachidi nella quarta settimana.
Il giorno 28, preparare l'estratto di arachidi a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro in PBS e utilizzare un termometro rettale per misurare la temperatura corporea di base di ogni animale sensibilizzato. Una volta misurate tutte le temperature, somministrare 200 microlitri di estratto di arachidi a ciascun ricevente tramite iniezione intraperitoneale e misurare la temperatura corporea con il termometro rettale ogni 15 minuti per un'ora dopo l'iniezione. Un calo della temperatura corporea indica un'allergia alle arachidi.
Dopo aver isolato gli splenociti dai topi allergici alle arachidi, utilizzare una siringa per insulina da un millilitro dotata di un ago da 27 e 5/8 pollici per iniettare per via endovenosa 1,5 per 10 al settimo degli splenociti allergici estratti nelle vene della coda di animali ingenui e nonsensibilizzati. Un giorno dopo il trasferimento adottivo, iniettare per via endovenosa 200 microlitri di liposomi antigenici Ara h 2 nella vena di coda di ogni topo BALB/c che ha ricevuto gli splenociti allergici. Due settimane dopo l'iniezione di liposoma, aumentare i topi con un i.p.
iniezione di Ara h 2 solubile, seguita da una sfida Ara h 2 da 200 microliter il giorno 61. Quindi, misurare le temperature corporee con la sonda rettale ogni 15 minuti come dimostrato. La coniugazione proteica può essere dimostrata eseguendo un gel riducente che mostra un aumento del peso molecolare rispetto alla proteina non coniugata.
Per valutare il flusso di calcio a cellule B stimolato dal liposoma antigenico, gate le singole cellule vive per consentire la selezione delle cellule B b220-positive CD5-negative. Il rapporto tra viola Indo-1 e fluorescenza blu Indo-1 nel tempo può quindi essere analizzato per valutare la quantità di attivazione delle cellule B indomito da liposomi. La quantificazione di Ara h 2-specific IgE e IgG1 nel siero di topi sensibilizzati agli estratti di arachidi da ELISA indica che i topi con sensibilità conferita che vengono potenziati con Ara h 2 mostrano ara h 2-specifici IgE e IgG1 misurabili nel loro siero.
Le temperature corporee registrate durante la sfida Ara h 2 rivelano che i topi allergici dimostrano una diminuzione delle temperature corporee a seguito della sfida, mentre le temperature corporee nei topi ingenui rimangono costanti. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere attentamente traccia della quantità di proteine lipidiche incorporate nei liposomi, poiché troppe proteine possono rendere difficile l'estrusione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il tracciamento e lo smistamento di cellule B e T specifiche degli allergeni per rispondere a domande aggiuntive su come queste cellule specifiche degli allergeni rispondono alle terapie.
Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo delle allergie per esplorare nuove immunoterapie che combattono le malattie allergiche usando questo modello di topo. Non dimenticare che lavorare con la tossina colera può essere pericoloso e che le linee guida per il suo uso dovrebbero essere seguite secondo i tuoi standard di sicurezza biologica istituzionali locali.
