Questo protocollo è progettato per scoprire i batteri nei tessuti ovarici e prevedere le loro funzioni. La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento dell'rRNA 16S sono stati utilizzati per scoprire e distinguere i batteri nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi in situ. Le differenze compensatrici e funzionali dei batteri sono previste utilizzando BoP e indagini cellulare-genetiche delle comunità mediante ricostruzione di giorni non osservati.
Il nostro protocollo mira a estrarre batteri dai tessuti ovarici in situ. Può anche essere usato per scoprire batteri in tumori di qualsiasi tipo. I principali vantaggi del nostro protocollo sono che è facile e conveniente, che può essere realizzato in quasi tutti i laboratori.
È anche rapido ottenere i risultati. Durante la pratica nel protocollo, è importante escludere eventuali batteri fuori sede tessuti tumorali. Pertanto, tutte le procedure in questo protocollo devono essere sterili.
Durante l'intervento chirurgico, separare le ovaie resecate in campioni di tessuto spessi circa un centimetro con un paio di nuove pinzette sterili. Evitare di toccare qualsiasi altra cosa durante l'intera procedura. Dopo la separazione, rimuovere il campione in un tubo sterile e metterlo in azoto liquido per la trasmissione.
Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Fissare i tessuti con la formalina e quindi incorporarli con la paraffina. Questo protocollo può essere messo in pausa qui.
I tessuti possono essere conservati a temperatura ambiente per una conservazione più lunga. Per eseguire ulteriori passaggi, tagliare i campioni in sezioni seriali a cinque micrometri. Quindi, asciugare i campioni.
Fare de-paraffina e reidratazione ai campioni. Per recuperare l'antigene, è necessario un trattamento a microonde di 10 minuti nel tampone EDTA. Immergere i campioni in PBS che contiene lo 0,3% di idrogeno.
Perossidizzare per 20 minuti per interrompere l'attività della perossidasi endogena. Eseguire l'anticorpo EMA al nucleo LPS, ad una concentrazione di 1 su 300. E mantenerlo per una notte a quattro gradi Celsius.
Per scoprire i batteri, utilizzare un kit di substrato DAP per rilevare l'esistenza di HRP. Sulla base delle istruzioni di un produttore, utilizzare il polimero HRP, l'anticorpo anti-coniglio. Utilizzare il concentratore da tavolo per consentire agli anticorpi di combinarsi completamente.
Utilizzare PBS per eliminare gli anticorpi non pettinati. Eseguire la colorazione chimica secondo le istruzioni del produttore, quindi lavare i campioni sott'acqua. Fai disidratazione ai campioni.
Campioni di abiti firmando. E inserisci come campione utilizzando la libreria di imaging Pro Plus Prepare basata sul protocollo del produttore. Pratica il modello di primer, che consiste nelle sequenze specifiche del gene e nelle sequenze nucleotidiche di sporgenza dell'adattatore Illumina.
Per amplificare i tassi di natalità per la regione V4 di 16s batterici su sequenze di geni rRNA, amplificare il modello dall'input del campione di DNA utilizzando amplicon PCR. Utilizzare perle magnetiche Mag-Bind RxNPure Plus per rimuovere la miscela di reazione dal prodotto PCR. Eseguire l'amplificazione PCR indicizzata per la seconda volta.
Utilizzare Agilent 2200 TapeStation per controllare la libreria. Utilizzare QuantiFluor dsDNA System per quantificare la libreria. Con un ciclo 600, la cella a flusso standard v3 produce circa 100.000 estremità accoppiate.
2 volte 300 base 3. Le librerie vengono denormalizzate, raggruppate e sequenziate. Le velocità grezze di ogni campione sono filtrate sulla base della qualità del sequenziamento da parte di Trimmomatic.
Le sequenze di primer e adattatore devono essere entrambe rimosse. Le letture di sequenza con entrambe le coppie e le qualità inferiori a 25 dovrebbero essere abbreviate. Analizza l'rRNA 16s dal pacchetto software QIIME.
Raccogliere sequenze per formare OTU con un cutoff di somiglianza al 97% Per le OTU, l'abbondanza relativa dovrebbe essere calcolata in ciascun campione. Utilizzare un classificatore bayesiano, che si trova nel set di formazione RDP per ordinare tutte le sequenze. Con una data OTU, una classificazione che ha la maggiore coerenza delle sequenze viene assegnata alle OTU.
Le OTA sono allineate al database Silva, sulla base di un campione di informazioni di gruppo. Eseguire la diversità alfa e l'analisi delle coordinate principali basata su UniFrac. Per prevedere la presentazione relativa delle caratteristiche dei batteri utilizzare BugBase.
Predire la composizione funzionale di un metagenoma a PICRUSt. Con l'utilizzo di dati di monitoraggio e un database contenente genomi di riferimento, analizza le diverse funzioni tra ciascun gruppo con l'aiuto del software STAMP. Utilizzare un software statistico per calcolare il risultato.
L'indicazione della significatività statistica deve essere impostata come p inferiore a 0,05. Calcola i fattori confondenti, che includono età e parità, dal t-test dello studente. Calcola lo stato della menopausa, la storia di ipertensione e diabete con il test Chi-quadrato.
Calcola il numero di taxa dei batteri ovaari con il test Mann-Whitney U. 16 pazienti sono stati arruolati in questo studio. BugBase è stato utilizzato per praticare l'analisi dei metagenomi previsti.
La potenziale patogenetica e immunoistochimica delle ovaie utilizzando anticorpi antibatterici LPS. Questa figura mostra la ricchezza batterica e la diversità nei gruppi di cancro e di controllo. Rivelato dal sequenziamento dell'rRNA 16S.
Le cifre sono osservate indice di specie. Indice Chao1, indice ACE, indice Shannon, indice Evenness, indice Simpson, rispettivamente. L'abbondanza relativa di phyla e delle 12 specie batteriche più abbondanti nei campioni ovarici è mostrata in questa figura.
Figura A, B, C e D.Indica l'abbondanza relativa del pannello nelle ovaie delle pazienti nel gruppo di controllo e nel gruppo di cancro ovarico. L'abbondanza relativa delle dodici specie di batteri più abbondanti nelle ovaie delle pazienti di controllo e del gruppo di cancro ovarico. Questo è più comune, raggruppato usando PCoA e l'abbondanza relativa di Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata.
La Figura A mostra i più comuni, che sono stati raggruppati utilizzando PCoA. PC1 e PC2 sono tracciati sull'asse x e sull'asse y. Il blocco rosso è uguale al campione nel gruppo del cancro ovarico.
Il cerchio blu è uguale a un campione nel gruppo di controllo. I campioni del gruppo di cancro ovarico possono essere separati da altri campioni nel gruppo di controllo. La figura B mostra i più comuni che sono stati raggruppati utilizzando PCoA.
PC1 e PC2 sono tracciati sugli assi x e y. Il blocco rosso è uguale a un campione nel gruppo del cancro ovarico. Il cerchio solido blu è uguale a un campione della paziente con mioma uterino.
E il cerchio cavo blu è uguale a un campione di una paziente con adenomiosi uterina. La figura C mostra l'abbondanza relativa di Anoxynatronum sibiricum. La figura D è Methanosarcina vacuolata.
Questa figura è l'analisi BugBase della metagenomica prevista. Il fenotipo potenzialmente patogenetico e ossidativo di tolleranza allo stress delle ovaie nel gruppo tumorale era più forte di quello del gruppo di controllo. Questa cifra è significativamente diversa dallo spazio del percorso KEGG tra il cancro e i gruppi di controllo mediante analisi PICRUSt.
Quando otteniamo i nostri campioni, è necessario un paio di nuove pinzette sterili. Prestare attenzione alla potenziale contaminazione dei campioni. Che i tessuti tumorali fuori sede dei batteri possono influenzare notevolmente la risoluzione.
È preferibile impostare il gruppo di controllo su ogni passaggio. Al fine di ridurre l'effetto della potenziale contaminazione.
