Una delle principali sfide nell'ingegneria di un tessuto cardiaco umano include la sua vascolarizzazione. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello in vitro del cuore umano co-coltivando cellule trovate in vivo. Questi includono miociti cardiaci, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali cardiache.
Tutte insieme, queste cellule consentono la ricapitolazione del microambiente cardiaco umano, compresi i suoi componenti molecolari, cellulari ed extra cellulari. Li usiamo nel nostro laboratorio per testare diversi farmaci alla ricerca di saggi sulla tossicità dei farmaci. Questi includono la doxorubicina, un noto farmaco cardiotossico che colpisce il cuore umano anche anni dopo il suo trattamento.
Coltimo separatamente fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali e miociti prima di formare sferoidi. Per coltivare cardiomiociti, raccogliamo il flaconcino da meno 80 gradi e lo riscaldamo a 37 gradi per quattro minuti in un bagno d'acqua. Quindi spruzziamo la fiala criogenica con il 70% di etanolo e la spostiamo in un armadio di biosicurezza.
Raccogliamo delicatamente la sospensione cellulare e la trasferiamo in un tubo Falcon da 15 millilitri. Raccogliamo un millilitro di mezzo di placcatura prebellico, risciacquiamo il flaconcino crio una volta e poi lo aggiungiamo al tubo Falcon da 50 millilitri, una goccia alla volta ogni quattro secondi. Mentre aggiungi il mezzo di placcatura, scuoti delicatamente il tubo Falcon.
Con una pipetta a cella, raccogliere sette millilitri di mezzo di placcatura e aggiungerlo delicatamente al tubo Falcon da 15 millilitri. Una volta aggiunto il volume finale del mezzo di placcatura al tubo Falcon, trasferire la sospensione cellulare ai contenitori di tessuto codificati con fibronectina. Infine, spostare le cellule in un'incubatrice.
Dopo due giorni, raccogliamo i contenitori di tessuto dall'incubatrice e controlliamo la confluenza cellulare al microscopio. A questo punto, spostiamo il pallone in un armadio di biosicurezza e rimuoviamo il mezzo di placcatura. Risciacquiamo delicatamente le cellule con lo stesso mezzo di placcatura dal pallone tissutale quattro o cinque volte.
Lo sostituiamo con un nuovo mezzo di manutenzione e li spostiamo in un incubatore per uno o due giorni aggiuntivi. Il giorno in cui creiamo impiccagioni di colture, raccogliamo tutti e tre i tipi di cellule dall'incubatrice. Ci scheggiamo nelle cellule rimuovendo il supporto.
Li risciacquiamo con tre millilitri di PBS. E infine aggiungiamo i trucioli nelle cellule. I contenitori vengono quindi spostati in un'incubatrice e incubati per un massimo di cinque minuti.
Per generare sferoidi cardiaci, co-coltimo 20.000 cellule per goccia appesa. Questi includono 10.000 cardiomiociti, mille fibroblasti cardiaci e 5.000 cellule interne cardiache. Questi sono co-coltivati in piatti a goccia sospesa 384 pozzi.
Sono placcati usando il nostro sistema di movimentazione dei liquidi. Aggiungiamo anche PBS sulle pareti laterali delle piastre di caduta appese per evitare che le colture si asciughino nell'incubatrice. Spostare con cura la piastra di caduta appesa contenente celle nell'incubatrice.
Tra i tre e i quattro giorni si formerà lo sferoide. Raccogliamo la piastra di caduta sospesa dall'incubatrice e controlliamo che gli sferoidi si formino all'interno di ogni pozzo. Come mostrato in queste immagini, abbiamo un insieme di sferoidi all'interno del centro di ogni pozzo.
Una volta formati, raccogliamo sferoidi e li incorporiamo nei gel di collagene. Una punta della pipetta viene tagliata all'interno in modo da prevenire danni allo sferoide. Gli sferoidi vengono raccolti e trasferiti in un tubo Falcon da 50 millilitri dove vengono riuniti.
Spiniamo giù la sospensione dello sferoide a 300 G per cinque minuti per separarli dal mezzo. Usiamo 96 piastre di pozzo con pareti scure per immaginire sferoidi, il supporto viene rimosso o sostituito con un gel di collagene in un tubo Falcon. L'idrossido di sodio viene aggiunto alla sospensione del gel sferoide prima che siano placcati nella piastra della parete scura.
100 microliter di sospensione dello sferoide vengono aggiunti in ogni pozzo e incubati per 30 minuti a 37 gradi. I farmaci, tra cui doxorubicina e altri agenti, vengono aggiunti alla piastra dello sferoide e incubati per 24 ore. Il giorno seguente, abbiamo preparato una soluzione contenente calcio AM e omodimero di etidio, etichettando vivono rispettivamente sotto le cellule.
Questa soluzione è preparata per aggiungere il centesimo a questa piastra filtrante. Gli sferoidi vengono quindi incubati a 37 gradi per un'ora. Usiamo un lettore di piastre per misurare la fluorescenza del calcio AM e il loro omodimero di etidio nella piastra.
Queste misurazioni vengono quindi utilizzate dal nostro software per eseguire un'analisi statistica. Misuriamo l'attività contrattile degli sferoidi trattati con i diversi farmaci utilizzando un sistema ottico ionico. Gli sferoidi vengono spostati allo stadio tra due elettrodi.
Ciò consente sia di controllare che di misurare l'attività contrattile in base al potenziale sul campo. In questo modo, possiamo testare diverse tensioni e intervalli di frequenza per stimolare gli sferoidi. Uno sferoide all'epoca è stato identificato e utilizzato per quelle misurazioni.
Gli sferoidi che non hanno ricevuto doxorubicina saranno in grado di costruire seguendo la stimolazione elettrica. Al contrario, gli sferoidi trattati con doxorubicina non si contrarranno. Per visualizzare la forma di rete cellulare endoteliale all'interno di ogni sferoide, li abbiamo fissati con una soluzione di paraformaldeide del 4% per un'ora a temperatura ambiente.
Abbiamo spostato la piastra su uno shaker che consente la delicata permeazione della soluzione attraverso il gel. Il PFA viene rimosso e risciacquato tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio. Abbiamo portato la mobilitazione ovviamente aggiungendo una soluzione allo 0,02% di Triton X in PVSA per 20 minuti a temperatura ambiente.
La soluzione di blocco contiene 3%BSA in PBC, che viene quindi aggiunto alla piastra per un'ora a temperatura ambiente. Una soluzione contenente l'anticorpo primario contro CD 31. Un marcatore per l'endoteliale viene aggiunto alla piastra che viene poi incubata durante la notte a quattro gradi.
Il giorno seguente, la soluzione di anticorpo primario viene rimossa e la piastra risciacquata tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio. La soluzione anticorpale secondaria contenente anche la macchia esagonale viene aggiunta alla piastra che viene poi incubata durante la notte a quattro gradi. Infine, la seconda soluzione anticorpale viene rimossa e la piastra risciacquata tre volte con una soluzione PBS contenente 0,01% di ossido di sodio.
Dopo essere rimasto con anticorpi primari e secondari, la piastra può essere immagine utilizzando il nostro microscopio confocale. Una corretta rete vascolare è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione delle cellule cardiache. Gli sferoidi cardiaci presentano una rete cellulare endoteliale che ricapitola meglio quella presente nel cuore umano rispetto alle colture monostrato delle cellule cardiache.
Date le caratteristiche uniche, gli sferoidi cardiaci rappresentano strumenti avanzati per i test in vitro per la ricerca cardiovascolare.
