L'imaging a cellule vive di array a cella singola chiamati LISCA sono anche una lettura automatizzata dei corsi di tempo fluorescenti di centinaia di singole cellule. Il vantaggio dell'approccio è che le singole risposte cellulari sono registrate da cellule isolate spazialmente in micro ambienti identici, consentendo un'analisi efficiente delle emissioni con grandi statistiche. Per fabbricare un array a cella singola, utilizzare un bisturi per tagliare un singolo capolavoro di PDM contenente sei micro strisce di polvere fuori dal livello PDM e posizionare il capolavoro sul banco da laboratorio con il micro pattern rivolto verso l'alto.
Utilizzare una lama di rasoio per tagliare ciascuna delle sei strisce di micropattern in un timbro PDM, tagliando alcune delle aree modellate per garantire che i bordi del timbro siano aperti. Successivamente, graffiare con cura il foglio protettivo del coperchio di uno scivolo a sei camere per contrassegnare le posizioni del canale dello scivolo e posizionare lo scivolo di copertura sulla panca con il foglio protettivo rivolto verso il basso. Utilizzare le pinzette per posizionare i timbri sul coperchio scivolare nelle posizioni del canale contrassegnate, con i micro motivi rivolti verso il basso, e controllare l'attacco dei francobolli al microscopio.
I quadrati a contatto con la diapositiva appariranno più scuri dell'interspazio. La qualità del motivo viene ridotta in base ai quadrati che non sono correttamente attaccati alla diapositiva. Se i timbri sono stati saldamente attaccati trattare lo scivolo di copertura e i timbri con plasma di ossigeno a 0,2 millibar di pressione e circa 40 Watt per tre minuti per far scivolare idrofile le superfici tra i timbri pdm e il coperchio.
Al termine della pulizia del plasma, posizionare il coperchio scivolare in un armadio di biosicurezza e aggiungere 15 microlitri di soluzione di poli-l-lisina pegilata ad ogni timbro in modo che la soluzione sia assorbita nel modello idrofilo del timbro. Dopo 20 minuti, sciacquare i francobolli con un millilitro di acqua ultrapura. Utilizzare una pinzetta per rimuovere i timbri dallo scivolo e sciacquare il coperchio scivolare una seconda volta con un secondo millilitro di acqua ultrapura.
Quando lo scivolo del coperchio si è asciugato completamente, attaccare uno scivolo appiccicoso a sei canali allo scivolo del coperchio facendo attenzione che le micro aree modellate si allineino con la parte inferiore dei canali. E aggiungere 40 microlitri di PBS e 40 microlitri di soluzione di fibronectina a ciascun canale. Per mescolare le due soluzioni, rimuovere 40 microlitri da un serbatoio e aggiungerlo al serbatoio opposto dello stesso canale tre volte per generare una soluzione omogenea.
Quando tutti i canali sono stati mescolati, incubare lo scivolo per 45 minuti a temperatura ambiente prima di lavare ogni canale tre volte con 120 microlitri di PBS per lavaggio. Scambia il PBS a 37 gradi Celsius, integra completamente il mezzo di crescita cellulare nei canali aggiungendo 120 microlitri medi a un serbatoio e rimuovilo dal serbatoio opposto. Aggiungere 40 microlitri di una sospensione di interesse di 400.000 cellule per millilitro e 40 microlitri di mezzo di crescita cellulare a ciascun canale e mescolare la soluzione cellulare con il mezzo come dimostrato.
Dopo la miscelazione, rimuovere 40 microlitri di sospensione da ogni canale in modo che solo i canali siano riempiti con sospensione cellulare e posizionare lo scivolo in un incubatore di coltura cellulare. Dopo un'ora, verificare l'adesione cellulare tramite microscopia a contrasto di fase e aggiungere 120 microlitri di 37 gradi Celsius di mezzo di crescita cellulare a ciascun canale, quindi riportare la diapositiva all'incubatore di coltura cellulare per altre tre ore. Per impostare un sistema di perfusione, collegare una siringa millilitro riempita con un mezzo di crescita cellulare di 37 gradi Celsius al tubo di ingresso del sistema e utilizzare la valvola per riempire il tubo con mezzo.
Collegare il tubo di ingresso al serbatoio di un canale, facendo attenzione che non siano intrappolate bolle d'aria, e collegare un connettore seriale al serbatoio opposto al tubo di ingresso del canale corrente. Collegare il resto dei canali come dimostrato fino a quando il numero richiesto di canali non è collegato in serie. E collegare il tubo di uscita direttamente al serbatoio libero del canale finale.
Quindi riempire il tubo collegato con il mezzo per confermare che il sistema di perfusione non perde. Per l'imaging time-lapse delle cellule, per impostare un protocollo time lapse per la registrazione di un'immagine di contrasto di fase e un'immagine a fluorescenza, impostare la configurazione ottica per l'imaging a contrasto di fase e l'imaging a fluorescenza. Utilizzare un obiettivo 10 volte superiore, i filtri a fluorescenza appropriati e un sistema automatizzato di correzione della messa a fuoco per garantire una migliore qualità dell'immagine per le misurazioni a lungo termine.
Selezionare un tempo di esposizione di 10 millisecondi per l'imaging a contrasto di fase e un tempo di esposizione di 750 millisecondi per registrare l'intensità di fluorescenza EGFP. Impostare una pianificazione temporale con un intervallo di tempo di 10 minuti tra i cicli consecutivi nell'elenco di posizione e un tempo di osservazione di 30 ore. Quindi, posizionare lo scivolo a sei canali sulla singola cantina sollevare nel portacampioni della camera di riscaldamento di 37 gradi Celsius del microscopio e rastrelare sul palco i tubi del sistema di perfusione.
Inserire le estremità libere dei tubi di uscita in un tubo conico da 15 millilitri per raccogliere i rifiuti liquidi. E impostare l'elenco delle posizioni per la misurazione del time lapse di scansione, facendo attenzione che il numero di posizioni possa essere scansionato entro l'intervallo di tempo definito tra cicli consecutivi attraverso l'elenco di posizione. Quindi iniziare la misurazione del time lapse.
Per la trasfezione delle cellule con un marcatore fluorescente, utilizzare una siringa per lavare il sistema di tubi con un millilitro di 37 gradi Celsius PBS, facendo attenzione che lo stadio del microscopio non si muova. Dopo il lavaggio, riempire il sistema con 300 microlitri di siero ridotto medio integrato con l'mRNA di interesse, ad una concentrazione finale di 0,5 nanogrammi di mRNA per microlitro, e lasciare incubare i lipoplex per un'ora. Alla fine dell'incubazione, sciacquare il sistema con un millilitro di 37 gradi Celsius mezzo di crescita cellulare completo per rimuovere qualsiasi mRNA non legato.
Al termine dell'analisi, visualizzare i canali elencati nel menu del canale e scorrere i tempi per ispezionare le celle preselezionate e i relativi segnali fluorescenti integrati. Fare clic su una cella di interesse per evidenziare il suo corso di tempo di fluorescenza o fare clic su un corso di tempo per trovare la cella corrispondente. Premere MAIUSC mentre si fa clic su una cella per selezionarla o deselezionarla.
Deselezionare tutte le celle che non sono vitali o non confinate in un punto di adesione o che sono attaccate a un'altra cella per escluderle da ulteriori analisi. Quando tutte le celle sono selezionate o deselezionate in modo appropriato, salvare i corsi di tempo a cella singola per l'area cellulare e la fluorescenza integrata in una directory appropriata. Per quantificare il tempo di insorgenza della traduzione dopo la trasfezione e la forza dell'espressione EGFP cellulare, è possibile utilizzare un modello di traduzione in tre fasi.
La soluzione modello per EGFP può essere adattata a corsi a tempo di cella singola come illustrato. Qui, si possono osservare istogrammi del tempo di insorgenza della traduzione e la velocità di espressione delle cellule trasfette lipoplex. Poiché entrambi i parametri sono stimati per ogni cellula, la correlazione di questi parametri può essere analizzata come dimostrato nella trama a dispersione, e confrontata con le cellule trasfette da nanoparticelle lipidiche.
Come illustrato, le cellule trasfette da nanoparticelle lipidiche mostrano una minore variabilità da cellula a cellula rispetto alle cellule trasfette da lipoplex. E la media della popolazione dimostra un inizio più rapido della traduzione, così come un tasso di espressione più elevato. Il nostro approccio può anche essere adattato a metodi alternativi di micro-patterning.
La cosa più importante per LISCA è un buon confinamento cellulare e una combinazione di analisi automatizzata delle immagini con una comoda supervisione dell'utente. Come avete visto, il comportamento cellulare è eterogeneo. E i film a tempo in singolo cella forniscono accesso a dinamiche imparziali delle reti biochimiche intrinseche.
Ad esempio, nell'espressione verde, l'apoptosi o i test di uccisione cellulare.
