Il nostro protocollo fornisce un metodo veloce, riproducibile e affidabile per generare monostrati epiteliali intestinali primari diretti su diverse superfici con detriti minimi. I principali vantaggi di questo protocollo sono il basso consumo di supporti e il mantenimento a basso costo della coltura cellulare. È un metodo rapido per eseguire test funzionali e applicazioni rapide a valle.
Questo protocollo fornirà informazioni sullo studio della riparazione delle ferite, della barriera di permeabilità e della migrazione transepiteliale di diversi tipi di cellule. Inoltre, questo modello può essere utile nell'interazione ospite-patogeno, nell'epiteliale danneggiato e nella scoperta di farmaci. Per iniziare, aggiungere 200 microlitri di soluzione di rivestimento a ciascun pozzo di una piastra da 48 porri e scivolo a camera.
Pre-incubare entrambi in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius per due ore. Rivestire inserti a membrana cellulare da 0,4 micrometri con 200 microlitri di soluzione di collagene. Incubare la piastra con gli inserti della membrana a quattro gradi Celsius per 30 minuti, quindi trasferirla in un incubatore di anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per due ore.
Disinfettare un topo eutanasiato con il 70% di etanolo, quindi sezionare il colon dal retto al cieco con l'aiuto di forbici e forcep. Sciacquare delicatamente le feci con PBS ghiacciato in una siringa da 10 millilitri dotata di un tubo di alimentazione calibro 20. Rimuovere il colon prossimale e far scorrere delicatamente il colon distale sul tubo di alimentazione calibro 20.
Legare il colon alla fine del tubo con 4-0 filo di sutura di seta. Invertire il colon all'interno sopra l'estremità legata e legare l'altra estremità con il filo, quindi tagliare il colon sotto la punta del tubo di alimentazione usando forbici chirurgiche. Aprire delicatamente l'estremità slegata del colon invertito sulla punta di una siringa ripetuta da 1,25 millilitri usando il suo pistone.
Far scorrere l'estremità slegata del due punti rovesciato sulla siringa e legarla strettamente con un filo. Inserire lo stantuffo nella siringa e gonfiare il colon fino a quando non sembra torbido senza rughe visibili. Mettere la salsiccia del colon gonfiata in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di soluzione di recupero cellulare sul ghiaccio per 20 minuti.
Gonfiare e sgonfiare il colon una volta ogni cinque minuti. Legare il colon gonfiato sotto la punta della siringa ripetuta usando 4-0 filo di sutura di seta. Tagliare la salsiccia del colon dalla siringa ripetuta e posizionare in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di EDTA da 50 millimolare per 40 minuti.
Ruotare il tubo a quattro gradi Celsius. Sostituire la soluzione EDTA con cinque millilitri di shake buffer e agitare manualmente la salsiccia in posizione verticale per due minuti. Decantare la soluzione di scuotimento in un nuovo tubo da 15 millilitri e ripetere il passaggio di scuotimento fino a raccogliere un totale di 10 millilitri di cripte e tampone di scuotimento.
Contare il numero di cripte in 20 microlitri della sospensione al microscopio e diluire il campione per ottenere la concentrazione di cinque cripte per microlitro. Centrifuga il campione della cripta a 400 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Nel frattempo, rimuovere la piastra da 48 pozzi e gli inserti a membrana dall'incubatore e posizionarla nell'armadio di biosicurezza.
Aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta P200 e lasciare la piastra con il coperchio leggermente sfalsata fino a quando le celle non sono pronte per essere placcate. Dopo la centrifugazione della sospensione della cripta, rimuovere il tampone di scuotimento e rimostrare il pellet intatto in tre millilitri di supporto completo LWRN. Aggiungere 200 microlitri di cripte a ciascun pozzo della piastra pre-rivestita a 48 porri e scivolo della camera e incubare entrambi in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius.
Il giorno dopo, aspira i media e aggiungi nuovi supporti. Generalmente, le cellule diventano confluenti in 24-48 ore. Per gli inserti a membrana di coltura cellulare, aggiungere 200 microlitri di cripte nella parte superiore degli inserti e 600 microlitri di supporti LWRN completi sul fondo.
Il giorno dopo, aspira i media e aggiungi nuovi supporti solo alla camera superiore. Incubare la piastra in un incubatore di anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Misurare la resistenza elettrica transepiteliale ogni giorno usando un volt/ohmmetro epiteliale.
Dopo aver isolato le cripte da un colon murino e verificato la concentrazione, la sospensione della cripta fu concentrata in cinque cripte per microlitro. I pozzi di piastra da 48 porsi sono stati sottoposti a un saggio di ferita da graffio al raggiungimento della confluenza cellulare. Dopo 24 ore, è stata osservata la riparazione della ferita che indica che la coltura era sana e vitale.
Valori di livello superiore sono stati raggiunti quando i supporti sono stati modificati da LWRN a supporti di differenziazione. Inoltre, è stata osservata una diminuzione dei marcatori ISC e un aumento dei marcatori di differenziazione che indicano che i monostrati differenziati sono stati generati con successo. Inoltre, la comparsa di sottotipi di cellule epiteliali differenziate coltivate in diverse condizioni è stata dimostrata dall'immunofluorescenza.
Quando si tenta questo protocollo, è importante assicurarsi che i due punti non si rompano in nessun momento durante la preparazione e rimangano gonfiati per rilasciare cripte in una preparazione estremamente pulita. Una volta che i monostrati a cellule epiteliali intestinali 2d si formano, possiamo eseguire test di immunofluorescenza, ferita da graffio e permeabilità e altre applicazioni a valle. Ciò fornirà conoscenze nella guarigione delle ferite, nella migrazione di diversi tipi di cellule e negli studi di riparazione epiteliale e danni.
