La raccolta di mezzi condizionati arricchiti di esosomi da cellule coltivate in contenitori bioreattori e l'isolamento mediante ultracentrifugazione a cuscino di saccarosio si traducono in una preparazione esosoma ad alto rendimento con proteine contaminanti minime o vescicole non esosomiche. L'uso di un unico cuscino di saccarosio preparato in ossido di deuterio elude la laboriosa preparazione di un gradiente di saccarosio discontinuo e riduce la quantità di saccarosio necessaria per raggiungere la densità richiesta. L'efficace somministrazione in vitro di siRNA incapsula in esosomi preparati in questo protocollo evidenzia il potenziale di questo sistema come terapia basata sull'interferenza dell'RNA di nuova generazione per il cancro al pancreas.
Per cominciare, coltura CELLULE HEK-293 in mezzo normale, come descritto nel manoscritto. Espandere le cellule in quattro contenitori T75 e crescere fino a raggiungere il 90% di confluenza. Per preparare un pallone bioreattore, aggiungere da 50 a 100 millilitri di mezzo normale nel serbatoio medio del pallone bioreattore per bagnare la membrana.
Raccogliere tutte le cellule HEK-293 dai quattro matracci T75 e rimornerle in 15 millilitri di mezzo impoverito di esosoma in un tubo di centrifuga. Quindi, utilizzare una siringa da 20 millilitri collegata a un ago di riempimento smussato per aggiungere con cura questa sospensione cellulare al compartimento cellulare del pallone bioreattore. Quindi, riempire il serbatoio medio del pallone bioreattore con il mezzo normale, fino a 500 millilitri, e incubarlo a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per una settimana.
Dopo una settimana di incubazione, rimuovere tutto il mezzo dal serbatoio medio del pallone bioreattore versarlo. Utilizzando una siringa da 20 millilitri collegata a un ago di riempimento smussato, rimuovere tutto il mezzo dal vano cellulare. Quindi, aggiungere da 50 a 100 millilitri di mezzo normale al serbatoio medio e 15 millilitri di mezzo fresco impoverito di esosomi nel vano cellulare utilizzando una siringa da 20 millilitri collegata a un ago di riempimento smussato.
Quindi, riempire il serbatoio medio del pallone bioreattore con mezzo normale fino a 500 millilitri. Incubare a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per un'altra settimana. Per pre-cancellare il mezzo condizionato raccolto, centrifugarlo a 500 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Trasferire il supernatante in un nuovo tubo e scartare il pellet. Dopo aver ripetuto questa fase di centrifugazione con il supernatante recuperato, recuperare nuovamente il supernatante e scartare il pellet. Quindi, centrifuga il supernatante recuperato a 2.000 volte g per 15 minuti e quattro gradi Celsius.
Mantenere il supernatante e scartare il pellet. Filtrare il supernatante una volta attraverso un filtro da 22 micrometri collegato a una siringa da 20 millilitri in un tubo di centrifuga fresco. Nel frattempo, per preparare una soluzione di saccarosio al 25% in ossido di deuterio, pesare accuratamente 1,9 grammi di saccarosio in un tubo universale.
Quindi, aggiungere l'ossido di deuterio fino a quando il peso raggiunge i 7,6 grammi. Quindi, riempire un tubo ultracentrifugo con 22,5 millilitri di mezzo condizionato pre-ripulito. Posizionare una pipetta di vetro nel tubo.
Aggiungere tre millilitri di soluzione di saccarosio attraverso la pipetta in modo che la soluzione formi uno strato separato sotto il mezzo condizionato. Posizionare con cura il tubo contenente soluzione di mezzo/saccarosio condizionata stratificata nel secchio di un rotore oscillante. Fissare il secchio nel rotore.
Posizionare il rotore nell'ultracentrifugo e ruotare a 100.000 volte g a quattro gradi Celsius per 1,5 ore. Raccogliere due millilitri dello strato di saccarosio dal tubo, un millilitro alla volta utilizzando una pipetta P1000, con la punta attaccata a una punta da 10 microlitri, e aggiungerlo a una bottiglia ultracentrifugo contenente 20 millilitri di PBS filtrato per il lavaggio. Posizionare il tubo in un rotore ad angolo fisso e centrifugarlo a 100.000 volte g a quattro gradi Celsius per 1,5 ore.
Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per rimuovere con cura il supernatante. Resuspend il pellet con 400 microlitri di PBS filtrato. Prima di iniziare l'elettroporazione, pre-raffreddare la cuvetta di elettroporazione sul ghiaccio per 30 minuti.
Mescolare sette microgrammi di esosomi con 33 microgrammi di siRNA nel tubo di microcentrifugo. Aggiungere tampone di acido citrico per ottenere il volume di 150 microlitri. Aggiungere la miscela esosoma-siRNA alla cuvetta di elettroporazione utilizzando una pipetta di plastica e limitare la cuvetta.
Posizionare la cuvetta nell'orientamento destro nel supporto della cuvetta dell'elettroporatore e ruotare la ruota di rotazione dell'elettroporatore di 180 gradi in senso orario. Selezionare il programma desiderato e premere il pulsante Start per avviare l'elettroporazione. Il display indicherà un impulso riuscito.
Quindi, tornare indietro della ruota di 180 gradi in senso antiorario e rimuovere la cuvetta. Utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere il campione dalla cuvetta in un nuovo tubo di microcentrifugo. Tenere il tubo sul ghiaccio o in frigorifero prima di un'ulteriore lavorazione, se non utilizzato immediatamente.
Per iniziare la rimozione libera del siRNA, passare 3,5 millilitri di PBS filtrato attraverso la colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni due volte per equilibrarla. Quindi, sciogliere 150 microlitri di campione elettroporato in 350 microlitri di PBS filtrato e trasferirlo nella colonna SEC. Raccogliere la prima frazione di 500 microliter eluitta dalla colonna in un tubo di microfugo e contrassegnarla come F0. Aggiungere quindi 500 microlitri di PBS filtrato alla colonna.
Raccogli la frazione successiva e contrassegnala come F1. Ripetere l'aggiunta del PBS e raccogliere le frazioni di eluizione fino a raccogliere un totale di 10 frazioni da 500 microliter, o fino a F9. Infine, per rimuovere eventuali residui di campione, lavare la colonna con PBS filtrato almeno due volte, quindi continuare con gli esperimenti, come descritto nel manoscritto. L'analisi morfologica mediante microscopia elettronica a trasmissione ha mostrato che gli esosomi HEK-293 erano strutture sferiche leggermente più grandi di 100 nanometri.
Questo risultato concorda con quello della misurazione dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle, che ha anche mostrato la distribuzione delle dimensioni degli esosomi. Inoltre, sono stati positivi per i marcatori esosomi CD81, CD9 e CD63. La percentuale di recupero degli esosomi purificati mediante cromatografia ad esclusione di dimensione e la percentuale di recupero del siRNA sono stati calcolati come descritto nel manoscritto.
Il recupero post-purificazione dell'esosoma è stato del 75%Utilizzando la curva standard del siRNA, l'efficienza di incapsulamento del siRNA negli esosomi è stata calcolata per essere circa il 10-20% Analisi qualitativa citometrica a flusso dell'assorbimento in vitro di esosomi caricati con Atto655-siRNA fluorescente ha mostrato che le cellule PANC-1 trattate con esosomi incapsulati da siRNA hanno avuto il più grande spostamento nel segnale di fluorescenza. Ciò è stato confermato dalla scoperta che le cellule PANC-1 trattate con esosomi incapsulati da siRNA hanno registrato una percentuale più alta di popolazione positiva per il segnale Atto655 rispetto a quella trattata con esosomi scaricati e miscela di siRNA. L'assorbimento cellulare del siRNA è stato anche significativamente più elevato nelle cellule PANC-1 trattate con esosomi incapsulati da siRNA rispetto a quella trattata con la miscela esosoma-siRNA, confermando che gli esosomi incapsulati da siRNA sono stati internalizzati dalle cellule PANC-1 e che forniscono efficacemente il siRNA intracellularmente.
È importante pesare il saccarosio e l'ossido di deuterio con molta precisione durante la preparazione della soluzione di saccarosio e utilizzare sempre una soluzione di saccarosio preparata al momento per evitare alterazioni della densità durante la conservazione. La microscopia confocale può essere effettuata per convalidare ulteriormente l'internalizzazione del siRNA incapsulato negli esosomi nelle cellule e studiarne il traffico intracellulare a seguito dell'assorbimento cellulare. Questo protocollo ci consente di valutare il knockdown specifico del gene del siRNA fornito dall'esosoma e funge da strumento per la convalida di nuovi obiettivi nella terapia del cancro basata sulle interferenze dell'RNA.
