Questo protocollo può essere utilizzato per valutare l'impatto delle mutazioni genetiche sulla funzione delle fibre muscolari. Inoltre, può essere utilizzato per studi di screening farmacologico volti a migliorare la salute muscolare. Questa tecnica può essere utilizzata per isolare e misurare la contrattilità in un gran numero di fibre muscolari in un periodo di tempo relativamente breve senza la necessità di un allenamento avanzato.
La composizione degli idrogel può essere modificata per attestare l'effetto dei segnali ambientali sia nel muscolo sano che in quello malato. La parte più impegnativa della procedura è la dissezione iniziale del muscolo. Se non viene prestata sufficiente attenzione, il danno al muscolo può portare ad una diminuzione della vitalità delle fibre muscolari.
A dimostrare la procedura saranno Leander Vonk, un tecnico di ricerca, e Osman Esen, un dottorando nel mio laboratorio. Inizia tagliando la zampa posteriore inferiore del topo eutanasia appena sopra la caviglia. Fai un'incisione sulla pelle sul lato dorsale del piede verso le dita dei piedi.
Sbucciare con cura la pelle verso le dita dei piedi facendo attenzione a non danneggiare il muscolo. Posizionare il piede sezionato in un piatto di protezione della guarnizione contenente 10 millilitri di mezzo di dissezione preriscaldato a 37 gradi Celsius. Appuntare il piede attraverso la pelle ancora attaccata alle dita dei piedi.
Appuntare la parte inferiore della gamba oltre la caviglia e asportare con cura il tessuto connettivo sulla parte superiore del muscolo. Tagliare il tendine al tallone e sollevare il muscolo. Tagliare accanto e sotto il muscolo attraverso il tessuto connettivo fino a quando i tendini della punta sono esposti.
Tagliare i tendini quando la metà della lunghezza di tre tendini è esposta. Rilasciare il muscolo dal piede e fissare i tendini dei muscoli FDB. Rimuovere qualsiasi tessuto connettivo residuo dal muscolo.
Trasferire il tessuto muscolare pulito in un tubo contenente un mezzo di dissezione preriscaldato. Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire il muscolo brevis in un tubo contenente il mezzo di digestione muscolare. Posizionare il tessuto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica per 80 minuti.
Trasferire il muscolo in un tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri di mezzo di dissezione. Utilizzando punte di triturazione preparate, pipettare il muscolo passando dal più grande al più piccolo e continuare la triturazione fino a quando le fibre muscolari si sono staccate dal tendine. I tendini possono essere rimossi con una punta P200.
Trasferire le fibre muscolari dissociate in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo di dissezione. Lasciare che le fibre si depositino nell'incubatore per 20 minuti fino a formare un pellet. Pipettare con attenzione tutto il mezzo dalla parte superiore del pellet di fibra.
Sul ghiaccio, risospendere le cellule in 875 microlitri di mix cellulare per muscolo. Aggiungere 125 microlitri di miscela di cellule della matrice in provette contenenti 125 microlitri di aliquota di sospensione cellulare. Mescolare mediante pipettaggio delicato, evitando la formazione di bolle.
Trasferire immediatamente la miscela finale in un pozzo. Controllare la vitalità delle fibre muscolari al microscopio. Mettere i gel in un incubatore per 30-45 minuti per favorire la solidificazione.
Una volta fatto, aggiungere con attenzione 500 microlitri di terreno di coltura in ciascun pozzetto. Accendere il sistema di misurazione contrattile basato sull'ottica, la lampada fluorescente, il pacer della cella elettrica e il computer. Impostare lo stimolatore elettrico a 1,0 hertz a 10 volt con una durata dell'impulso di cinque millisecondi per stimolare le fibre muscolari isolate.
Inserire la piastra nel sistema di misurazione. Collegare il pacer all'inserto e inserirlo nella piastra di coltura. Aprire il programma IonWizard.
Fare clic su OK. Aprire un nuovo file facendo clic sull'icona File, quindi fare clic su Nuovo. Selezionare Raccogli esperimento per verificare se il programma è sul sarcomero scheletrico dell'esperimento corretto. Per modificare l'esperimento, fare clic sull'esperimento desiderato e quindi premere Aggiungi.
Applicare le impostazioni SARC 20X, linee medie, FFT singolo, frequenza di campionamento 250 hertz e un tempo di acquisizione di 10 secondi. Modificare la temperatura del sistema di misurazione a 25 gradi Celsius. Fare clic sul cercatore di celle aperto per creare un nuovo popup dello schermo.
Selezionare Tipo piastra (Plate Type) e Pozzetti attivi. Metti a fuoco le fibre regolando la barra di scorrimento della messa a fuoco. Consentire alla stimolazione di indurre la stimolazione elettrica e osservare le contrazioni delle fibre.
Mantenendo i sarcomeri a fuoco, assicurarsi che l'area di misurazione sia fissata sull'estremità della fibra in modo tale che i sarcomeri corrano verticalmente. Quando i sarcomeri sono focalizzati, un singolo picco è visibile nella barra degli strumenti che si sposterà verso destra dopo la contrazione. Misurare le fibre sul sistema di misurazione.
Fare clic su Avvia per iniziare l'esperimento. Premere il tasto Q per iniziare a misurare 10 transitori di contrazione. Se più di quattro transitori sembrano privi di rumore, accettare la misurazione premendo il tasto Z.
Se i transitori contengono troppo rumore, rifiutare le misurazioni. Premere Stop per chiudere la finestra del cercatore di celle al termine dell'esperimento. Salvare il file e creare un nuovo file.
Aprire il programma CytoSolver desktop, quindi fare clic su Importa e selezionare i file da analizzare. Una volta completata l'analisi, identificare i picchi blu, rosso e grigio. Clicca su Esporta.
Selezionare le caselle da Media a Dati transitori ed esportare in Excel. Una percentuale più elevata di misurazioni del muscolo contrattile utilizzabile è stata ottenuta nell'idrogel di fibrina 3D poiché impediva i movimenti laterali e altri fattori di influenza. L'incorporazione delle fibre non ha avuto alcun effetto significativo sulla massima velocità di contrazione o sull'accorciamento del sarcomero.
È stata osservata una ridotta contrazione nella matrice basale pura, probabilmente a causa della rigidità del gel o dell'aumentata interazione della matrice cellulare. Allo stesso modo, l'incorporazione della matrice basale ha anche ridotto l'accorciamento del sarcomero rispetto all'idrogel di fibrina. È importante ricordare che le fibre muscolari isolate sono piuttosto fragili e bisogna prestare particolare attenzione a non danneggiarle durante il pipettaggio.
Dopo la procedura di isolamento, possono essere eseguiti anche metodi come l'immunocolorazione, l'isolamento di proteine e RNA. Lo sviluppo di questa tecnica ha aperto nuove possibilità per studiare la funzione delle fibre muscolari mature in modo ad alto rendimento.
