Il mantenimento della redditività potenziale degli ovocite dopo lo stoccaggio a lungo termine rappresenta uno strumento di grande opportunità, in quanto migliorerebbe l'allevamento domestico degli animali mediante programmi di selezione genetica, contribuirebbe a preservare la biodiversità attraverso la conservazione delle specie selvatiche e aumenterebbe la ricerca biotecnologica. La vetrificazione degli ovocite giovanili era molto più breve nell'intervallo di generazione nei programmi di riproduzione. La vitrifaction mediante raffreddamento ultrarapido e riscaldamento è considerata un approccio standard nella conservazione degli ovociti bovini.
Tuttavia, negli ovini questa procedura è ancora considerata relativamente nuova e manca un metodo standard. In questo video, descriviamo un protocollo per la vetrificazione degli ovociti ovini, raccolto da donatori giovani e adulti e maturato in vitro prima della crioconservazione. Il protocollo include tutte le procedure dalla maturazione in vitro, vetrificazione, riscaldamento e cultura post-riscaldamento.
Dopo aver recuperato il complesso di ovociti Cumulus, dove è maturato in vitro per 24 ore in condizioni statiche che includono per l'ovociti giovanile, l'integrazione con cento micromolari di trealosio nel mezzo di maturazione. Dopo la maturazione in vitro, gli ovociti sono stati denudati meccanicamente delle cellule di Cumulus mediante pipettazione delicata ed esaminati al microscopio stereo, con ingrandimento 60x. La selezione degli ovociti da sottoporre alle procedure di vetrificazione rappresenta il primo passo importante per garantire l'applicazione positiva di questa procedura.
Devono essere selezionati solo quelli con il citoplasma uniforme, con distribuzione omogenea delle goccioline lipidiche, integrità di tutta Emma ampia e continua cardina nello spazio, zona pellucida compatta del diametro esterno di circa 19 micrometri e che mostra l'estrusione del primo corpo polare, e quindi allo stadio M2. La vetrificazione è stata eseguita utilizzando il metodo del volume essenziale minimo, con un dispositivo Cryotops. Dopo la selezione, un gruppo di cinque ovociti giovanili è stato condizionato a 38,5 gradi Celsius in mezzo di base per due minuti.
Gli ovociti sono stati poi disidratati per tre minuti di esposizione a una soluzione di taratura. Il caricamento dell'ovocita nel dispositivo di vetrificazione utilizzato è un passaggio importante e critico. Cryotop utilizza una striscia di polipropilene attaccata a un supporto.
In questo metodo, gli ovociti nella soluzione di vetrificazione, meno di 0 punti millilitro vengono rapidamente caricati con un capillare di vetro sopra la striscia di pellicola. Quindi la soluzione deve essere rimossa, lasciando dietro di sé uno strato sottile sufficiente a coprire le cellule da essere crioconservate. Prima di essere caricato nel dispositivo Cryotop e immerso direttamente nell'azoto liquido entro 30 secondi.
Per la temperatura biologica interna calda, il contenuto di ciascun dispositivo di vetrificazione è stato trasferito dall'azoto liquido in 200 gocce di microliter di soluzione di trealosio decrescente. Gli ovociti sono stati trasferiti insieme è stato, trascinando gli ovociti con una sottile pipetta di vetro, per promuovere la rimozione dei crioprotettivi intracelulari. Infine, gli ovociti sono stati pre-allenati in un mezzo di base in incubatrice in anidride carbonica al 5%.
Immediatamente dopo il riscaldamento, e per ogni punto di tempo della coltura post-riscaldamento, gli ovociti sono stati morfologicamente valutati utilizzando un microscopio invertito con ingrandimento 100x. La crio tolleranza degli ovociti dei donatori giovanili è inferiore rispetto a quelli alterati con minore integrità della membrana dopo il riscaldamento. L'uso di trealosio nel mezzo di maturazione indotto negli ovociti giovanili una maggiore integrità della membrana, aumentando i tassi di sopravvivenza dopo la vetrificazione.
Tuttavia, la scissione, la fecondazione e i tassi di sviluppo degli ovociti giovanili non sono stati aumentati dal completamento del trealosio. L'impiego di mezzi con concentrazione di calcio pari a 2,2 milligrammi deciliter per la vetrificazione degli ovociti giovanili, qualora si riscontri tassi di concimazione più elevati rispetto agli ovociti vetrificati con concentrazione di calcio, ma non sono state riscontrate differenze che consentano la produzione. Confrontando la cultura post-riscaldamento su durate diverse, abbiamo dimostrato che dopo quattro ore di coltura gli ovociti raccolti dai due più vecchi sono in grado di recuperare i legami energetici e la configurazione microtubulare e di ripristinare la competenza di sviluppo con una maggiore scollatura e sprechi di blastociti.
L'attività mitocondriale era più alta negli ovociti giovanili caldi vetrificati dopo quattro ore di coltura post-riscaldamento, rispetto ad altri punti di tempo. Anche la parte di distribuzione mitocondriale è cambiata durante sei ore di coltura post-riscaldamento. Inoltre, i livelli intracellulari delle specie di ossigeno reattivo erano significativamente più bassi negli ovociti giovanili a due ore di coltura post-riscaldamento rispetto a 0, 4 e 6 ore.
Tuttavia, e in contrasto con quanto trovato in altri ovociti, i tassi di attivazione partinogena spontanea aumentarono durante la coltura post-riscaldamento negli ovociti giovanili. Uno dei principali vantaggi del metodo proposto è che include tutti i passaggi dalla raccolta degli ovocite alla maturazione in vitro, alla vetrificazione e al riscaldamento. Inoltre, comprende un periodo di coltura post-riscaldamento per consentire il recupero degli ovocite dai danni subiti durante la procedura di vetrificazione.
Scegliere il tempo ottimale per la fecondazione è impegnativo e può influire sull'esito del programma di vetrificazione. Va anche considerato che, a differenza del congelamento lento, la vetrificazione è una tecnica manuale ed è quindi dipendente dall'operatore. Per questo motivo, una sfida importante è la necessità di tecnici e ricercatori qualificati che prendano in considerazione l'effetto operatore nella valutazione dei risultati del programma di vetrificazione.
Ulteriori studi del nostro laboratorio consentiranno di tentare di standardizzare la procedura e la selezione della vetrificazione degli ovocite e di adattare meglio la composizione dei supporti alle esigenze dell'ovocita giovanile. Un disprezzo per l'uso della cultura e del carattere e antiossidante offriamo opportunità promettenti.
