In questo protocollo video, dimostriamo in dettaglio un sistema di coltura per la coltivazione di ovociti bovini. Il sistema supporta la vitalità degli ovociti nella cultura per un massimo di cinque giorni e consente la loro differenziazione. Utilizzando questo sistema di coltura, gli ovociti raccolti da piccoli follicoli astrali, che normalmente non sono utilizzati nei protocolli standard per l'in vitro nella produzione, possono essere coltivati per aumentare la disponibilità di gameti fertilizzabili.
Questo sfruttamento della riserva più ampia può fornire nuove opzioni per il recupero genetico di specie minacciate, della famiglia bovina o di razze locali a rischio di erosione genetica. Per iniziare, preparare 15 millilitri di terreno di coltura di base e completarlo secondo le indicazioni manoscritte. Successivamente, preparare tre millilitri di mezzo di tenuta aggiungendo cinque cilostamide micromolare al mezzo di coltura di base e versarlo in una piastra di Petri da 35 millimetri.
Preparare un lungo mezzo IVCO integrando il mezzo di coltura di base secondo le indicazioni manoscritte. Aggiungere 200 microlitri di mezzo IVCO lungo ad ogni pozzo di una piastra rivestita a 96 porri. Quindi riempire i quattro bordi con acqua sterile per compensare l'evaporazione e mantenere l'umidità appropriata durante la coltura.
Incubare la piastra da 96 pozzi e il mezzo di tenuta a 38,5 gradi celsius e il 5% di anidride carbonica con umidità massima. Lavare le ovaie quattro volte in soluzione salina sterile, mantenuta a 26 gradi Celsius. Quindi aspirare tutti i follicoli di diametro superiore a due millimetri, con un ago calibro 18 collegato a una pompa di aspirazione.
Allaga le ovaie aspirate in un becher con soluzione salina sterile mantenuta a 26 gradi Celsius. Posizionare un'ovaia alla volta su un tagliere PTFE sterile e utilizzare una lama chirurgica numero 22 per tagliare fette di corteccia ovarica dello spessore da 1,5 a due millimetri e parallele all'asse principale dell'organo. Allattare le fette di corteccia ovarica in una piastra di Petri di vetro sterile, con mezzo sezionante su un piatto caldo, a 38,5 gradi celsius.
Pizzo una fetta di corteccia ovarica in una piastra di Petri di vetro da 60 millimetri, con due o tre millilitri di M199D al microscopio a dissezione, selezionare i follicoli che sono tra i 5 e i due millimetri. Identificare i follicoli non atretici sani al microscopio stereo, osservando parametri morfologici, come un aspetto traslucido uniformemente luminoso, un'ampia vascolarizzazione e un normale strato di granulosa. Mentre i follicoli atretici hanno un aspetto opaco grigio e sono scarsamente vascolarizzati, con un COC scuro all'interno.
Scartare i follicoli atretici ed elaborare tutti gli altri. Utilizzare la lama chirurgica per rimuovere il tessuto ovarico che circonda il follicolo su un lato, fino a quando non viene esposto. Quindi utilizzare un ago calibro 26 per fare con cura una fessura nella parete del follicolo esposta, che rilascerà il contenuto follicolare che comprende coc, liquido follicolare e ciuffi di cellule.
Identificare il COC ed esaminarlo per l'integrità cumulica, l'integrità della zona pellucida e l'omogeneità del citoplasma. Se questi criteri sono soddisfatti, aspirare il COC con una pipetta P20. Allagare il COC isolato nella cilostamide M199D e continuare la procedura di isolamento per 30 minuti.
Dopo aver selezionato i COC, come descritto in precedenza, preparare 16 gocce con 20 microlitri di cilostamide M199D in una piastra di Petri da 60 millimetri e mettere un COC sano in ogni goccia. Utilizzare un microscopio invertito collegato a una telecamera per misurare il diametro degli ovociti, esclusa la zona pellucida. Con una chiara visualizzazione dell'ovocita, effettuare due misurazioni perpendicolari, assicurare che la media delle due misurazioni sia entro un intervallo da 100 a 110 micrometri.
Può essere difficile misurare con precisione il diametro degli ovociti, a causa delle cellule cumuliche compagno. I COC con ovociti con diametro inferiore o maggiore, o che non hanno un ovociti arrotondato, o quelli con ovociti non misurabili, devono essere scartati. Trasferire i COC selezionati in un piatto da 35 millimetri contenente mezzo M199H e mantenerli nell'incubatrice a 38,5 gradi celsius e 5% di anidride carbonica con umidità massima, assicurarsi che l'orario di lavoro complessivo non superi le due ore.
Una volta completate le procedure di selezione e raccolta, trasferire un COC al centro di ogni pozzo della piastra da 96 pozzi precedentemente preparata. Incubare la piastra per cinque giorni a 38,5 gradi celsius e 5% di anidride carbonica con umidità massima, rinfrescare il mezzo a giorni diversi. Per rinnovare il mezzo, sostituire 100 microlitri di vecchio mezzo con 100 microlitri di mezzo IVCO fresco lungo, farlo al microscopio stereo per evitare di spostare i COC.
Al termine del lungo IVCO, analizzare la morfologia dei COC. Se hanno un investimento compatto in cellule cumuliche senza alcun segno di espansione cumulo, o degenerazione cellulare, classificarli come classe uno. Se i COC hanno un investimento compatto di cellule cumuliche senza alcun segno di espansione cumulo o degenerazione cellulare, e con una o più formazioni simili ad antrum, classificarli come classe due.
I COC di classe tre mostrano diversi strati di cellule cumuliche senza alcun segno di espansione cumulo, alcune cellule disaggregate nello strato esterno delle cellule cumuliche e nessuna formazione simile all'antrum. Classificare i COC come classe quattro se mostrano un'abbondante perdita di cellule cumuliche che si estendono per oltre il 50% della superficie degli ovociti, così come segni di degenerazione cellulare e detriti cellulari. Alla fine del lungo IVCO la morfologia lorda del COC viene modificata.
E quattro classi sono state identificate in base all'aspetto delle cellule cumuli. Complessivamente, sono stati analizzati 74 ovociti in cinque repliche biologiche, di cui il 9,45% è stato scartato da ulteriori valutazioni. Le classi uno, due e tre furono giudicate sane, mentre la quarta classe mostrò chiari segni di degenerazione, come l'assenza di strati completi di cellule cumuliche che circondavano gli ovociti.
Questi COC sono stati considerati inadatti a sottoporsi a procedure a valle in un potenziale ambiente IVP. La valutazione della fase meiotica alla fine del lungo IVCO ha mostrato che una percentuale significativamente più elevata di ovociti è rimasta arrestata nella fase immatura, con la cromatina ancora racchiusa all'interno del GV. Quando la condensazione della cromatina all'interno del GV è stata studiata come indicatore di guadagno di competenza, la transizione della configurazione della cromatina a stadi più condensati, vale a dire GV due e GV tre, è stata osservata nel 59% degli ovociti. Una piccola percentuale ha ripreso la meiosi raggiungendo la metafase in uno stadio, o degenerazione.
Questi risultati dimostrano che la cultura L-IVCO supporta la vitalità degli ovocite, impedendo al contempo la ripresa meiotica per cinque giorni. Alla fine del lungo IVCO, i COC possono essere utilizzati nelle procedure a valle della produzione di embrioni in vitro, vale a dire la maturazione in vitro, la fecondazione e la coltura embrionale. Queste misure sono necessarie per fornire la prova del concetto che l'ovocita ha acquisito una maggiore competenza allo sviluppo.
Oltre a mantenere il potenziale di aumentare la quantità di ovociti fertilizzabili, il lungo sistema di coltura IVCO è uno strumento per gli scienziati interessati a sezionare i processi cellulari e molecolari che regolano la formazione di un gamete competente.
