Le vie di segnalazione che controllano i sistemi multicellulari sono dinamiche. Per comprendere la funzione di queste dinamiche, è essenziale essere in grado di modulare sottilmente queste dinamiche senza influenzare l'attività di segnalazione complessiva. Questo protocollo utilizza un sistema microfluidico che consente la dissezione funzionale delle oscillazioni di segnalazione nello sviluppo di embrioni di topo.
Le dinamiche di segnalazione sono state trovate in molti tessuti, compresi quelli adulti. La microfluidica è uno strumento versatile che può essere adattato per adattarsi a molti sistemi modello, tra cui colture cellulari, tissutali e organoidi. Per iniziare, preparare la quantità richiesta di PDMS mescolando il monomero con il catalizzatore in un rapporto nove a uno per indurre la polimerizzazione.
Utilizzare strumenti usa e getta e assicurarsi che la miscelazione sia correttamente raggiunta. Posizionare la miscela PDMS in un essiccatore e applicare sottovuoto per circa 30 minuti per rimuovere l'aria. Versare uno strato PDMS di circa tre o cinque millimetri nello stampo del truciolo e riposizionare nell'essiccatore per circa 30 minuti.
Polimerizzare lo stampo mettendolo in forno durante la notte a 65 gradi Celsius o inferiore a seconda del materiale dello stampo. Tagliare il chip dallo stampo usando un bisturi. Fori di ingresso e di uscita con un punzone per biopsia di un millimetro a partire dall'interno della camera microfluidica.
Pulire la slitta di vetro con aria compressa. Per incollare il chip al vetrino, posizionare il chip e il vetrino nel forno al plasma con i lati da incollare rivolti verso l'alto. Generare plasma utilizzando il protocollo specifico per la macchina utilizzata, quindi legare il chip al vetro posizionando le superfici attivate l'una sull'altra e applicando la pressione in modo uniforme.
Per preparare il tubo e il chip per l'esperimento, tagliare il tubo con un angolo di 45 gradi e attaccare un ago a ciascuno dei tubi. Posizionare il tubo con gli aghi, il chip e i tappi in un piatto e sterilizzarli esponendoli alla luce ultravioletta per circa 15 minuti. Per rivestire il chip con fibronectina, posizionare il chip in un becher contenente PBS più 1% di penicillina o streptomicina a temperatura ambiente.
Lavare il chip con PBS per rimuovere l'aria con una pipetta P200. Caricare una siringa da tre millilitri per ogni camera del chip. Attaccare l'ago alla siringa contenente fibronectina e collegare la siringa alla pompa della siringa.
Lavare manualmente i tubi per rimuovere l'aria. Collegare il tubo di uscita all'uscita del chip. Assicurati di spingere il tubo fino in fondo e imposta una bassa portata per rivestire il chip.
Lasciare funzionare la pompa della siringa per almeno due ore o durante la notte. Al termine, arrestare la pompa e tagliare il tubo subito dopo l'ago. Preparare siringhe riempite con il mezzo per l'esperimento e degasare sia il terreno di coltura che il chip all'interno di PBS.
Cercare di scovare o aspirare la maggior parte delle bolle d'aria dal chip, quindi installare le siringhe nelle pompe e collegare i tubi di ingresso alle siringhe. Per caricare il tessuto sul chip, sezionare la punta più posteriore della coda. Lavare il chip con il terreno di coltura con 25 HEPES micromolari per rimuovere il PBS.
Caricare il tessuto nel chip utilizzando una pipetta P200. Dopo ogni fase di caricamento del tessuto, chiudere l'ingresso di carico del tessuto corrispondente utilizzando un pezzo di tubo riempito con PDMS. Per assemblare la configurazione microfluidica, collegare il tubo al chip microfluidico senza ottenere bolle d'aria all'interno.
Per fare ciò, assicurarsi che ci sia una goccia di mezzo presente all'estremità del tubo. Una volta che tutto il tubo è attaccato al chip, estrarlo dal becher e metterlo in un piatto contenente un fazzoletto bagnato. Metti il piatto e circa 1,5 metri di tubo di ingresso in un'incubatrice per la coltura notturna.
Garantire un'elevata umidità per prevenire la formazione di bolle d'aria durante la coltura. In alternativa, asciugare l'esterno del chip e posizionarlo in un supporto per microscopio, quindi posizionare il supporto e circa 1,5 metri di tubo di ingresso all'interno della camera di incubazione di un microscopio invertito per un esperimento di imaging dal vivo. Dopo almeno 20 minuti di flusso costante, avviare il pompaggio pianificato per l'esperimento.
Per intrappolare la segnalazione notch nell'embrione di topo segmentante, utilizzare un programma di pompaggio di 100 minuti medi e 30 minuti di impulsi di droga ripetuti fino alla fine dell'esperimento, in genere per 24 ore. Per l'imaging in tempo reale, iniziare a eseguire l'imaging dopo almeno 30 minuti. Per confermare il trascinamento delle oscillazioni di segnalazione, più esperimenti sono allineati utilizzando i tempi degli impulsi del farmaco e visualizzati con il colorante Cascade Blue.
Le oscillazioni quantificate possono essere detrended e visualizzate come deviazione media e standard o fasi delle oscillazioni possono essere calcolate. È possibile analizzare la relazione di fase tra le oscillazioni di colture embrionali posteriori indipendenti tra loro e con gli impulsi esterni del farmaco. Per confermare il trascinamento, si può ad esempio determinare il periodo delle oscillazioni di segnalazione endogene usando il programma basato su Python pyBOAT.
Quando si applicano impulsi con un periodo di 130 minuti, le oscillazioni di segnalazione notch mostrano anche un periodo di 130 minuti. È fondamentale prevenire l'evaporazione del liquido durante l'esperimento microfluidico. Altrimenti, nel chip si formeranno bolle d'aria che interferiscono con il flusso medio.
Per evitare ciò, degassare il mezzo e il chip e assicurarsi che l'umidità nell'incubatore sia abbastanza alta. Utilizzando questo metodo, la dinamica di segnalazione può essere modulata e i loro effetti possono essere analizzati mediante imaging in tempo reale di reporter fluorescenti, immunocolorazione o ibridazione in situ. Inoltre, il tessuto può anche essere estratto dal chip per ulteriori analisi.
Si può usare questo metodo per studiare la funzione delle oscillazioni di segnalazione nello sviluppo embrionale. È stato applicato per dimostrare l'importanza dello sfasamento tra due vie di segnalazione oscillanti per la segmentazione dell'embrione di topo. Più in generale, ora può essere utilizzato per sezionare il meccanismo della codifica di segnalazione dinamica nei sistemi multicellulari.
