Piccole molecole di segnalazione prendono di mira varie proteine emozionali per controllare la virulenza batterica e la biologia umana. Tuttavia, queste proteine emozionali sono difficili da identificare. Come strumento di biologia dei sistemi, DRaCALA consente un'identificazione fattibile, rapida e altamente sensibile delle proteine emozionali sconosciute utilizzando una libreria OVium.
DRaCALA potrebbe essere usato per studiare qualsiasi piccola molecola di segnalazione purché possa essere etichettata con isotopi radioattivi o coloranti fluorescenti. Inizia inoculando E.coli in 1,5 millilitri di LB integrati con 25 microgrammi per millilitro cloramfenicolo in ogni pozzetto di piastre di pozzo profonde 96 pozzetti per un'incubazione notturna a 30 gradi Celsius e 160 rotazioni al minuto. La mattina successiva, trattare le colture notturne con 500 IPTG micromolari per sei ore a 30 gradi Celsius per indurre l'espressione proteica.
Alla fine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione, rimuovere il surnatante e congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius. Per avviare la lisi, risuscidere i pellet in 150 microlitri di tampone di lisi uno per pozzetti per un'incubazione di 30 minuti a meno 80 gradi Celsius prima di scongelare le cellule per 20 minuti a 37 gradi Celsius. Il lisirato deve quindi essere conservato a meno 80 gradi Celsius prima dell'uso.
Per completare la lisi delle cellule con proteine sovraespresse, risospendare i campioni in 40 millilitri di tampone di lisi ghiacciata due e sonicare i campioni a un'ampiezza del 60% a due secondi su quattro secondi per otto minuti, quindi eliminare i lasati mediante centrifugazione. Mentre i campioni vengono centrifugati, aggiungere 500 microlitri di resina nichel-NTA omogeneizzata a una colonna di cromatografia in polipropilene in piedi. Dopo 15 minuti, lavare la resina depositata due volte con 15 millilitri di acqua ultrapura e una volta con 15 millilitri di tampone di lisi due.
Al termine della centrifugazione, caricare il surnatante di lisi eliminato sulla colonna. Quando tutto il lisiato è fluito attraverso la colonna, lavare la colonna con 30 millilitri di tampone di lavaggio. Per eluire le proteine, aggiungere un volume di 400 microlitri di tampone di eluizione alla colonna e ripetere l'eluizione tre volte.
Un altro volume di 300 microlitri del tampone di eluizione per ripetere l'eluizione tre volte e combinare le proteine eluite in un volume finale di 700 microlitri. Per la filtrazione su gel del campione eluito, dopo aver lavato una colonna di esclusione dimensionale con 25 millilitri di tampone di filtrazione in gel appena preparato, caricare l'intero volume di proteine eluite sulla colonna utilizzando un anello da 500 microlitri. Eseguire a 500 microlitri al minuto e raccogliere da due a tre frazioni di volume da 500 microlitri delle rispettive proteine.
Quindi utilizzare singole colonne di spin per concentrare ciascuna proteina e utilizzare il kit di analisi Bradford per misurare le concentrazioni proteiche secondo protocolli standard. Per sintetizzare il fosforo 32 etichettato guanosina pentafosfato, assemblare una reazione di Relseq su piccola scala in un tubo con tappo a vite come indicato nella tabella e incubare la reazione in un Bimbyer per un'ora a 37 gradi Celsius e cinque minuti a 95 gradi Celsius, seguita da cinque minuti sul ghiaccio. Alla fine delle incubazioni, far girare la proteina precipitata per centrifugazione e trasferire il fosforo sintetizzato 32 etichettato guanosina pentafosfato contenente surnatante in un nuovo tubo tappo a vite.
Per la sintesi di fosforo 32 guanosina tetrafosfato, aggiungere un GppA micromolare a metà del prodotto di guanosina pentafosfato etichettato fosforo 32 in un nuovo tubo tappo a vite e incubare la reazione per 10 minuti a 37 gradi Celsius, cinque minuti a 95 gradi Celsius e cinque minuti sul ghiaccio. Alla fine dell'incubazione, ruotare il precipitato per centrifugazione e trasferire il fosforo 32 etichettato guanosina tetrafosfato contenente surnatante in un nuovo tubo. Per analizzare le proteine bersaglio isolate, eseguire un microlitro di ciascun campione su una piastra cromatografica a strato sottile utilizzando 1,5 fosfato monopotassico molare come fase mobile.
Dopo l'analisi, posizionare la piastra essiccata in una cartella di plastica trasparente ed esporre la piastra a uno schermo di fosforo di stoccaggio per cinque minuti prima di visualizzare e quantificare i dati su un imager al fosforo. Per lo screening DRaCALA delle proteine bersaglio, aggiungere 20 microlitri dei lasati all'ingrosso scongelati ai singoli pozzetti di una piastra di microtitolato a V a 95 pozzetti e aggiungere 2,5 unità di endonucleasi Serratia marcescens a ciascun pozzetto. Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, posizionare i lasati sul ghiaccio per 20 minuti.
Quindi, mescolare volumi uguali di fosforo 32 guanosina pentafosfato e guanosina tetrafosfato etichettati e aggiungere 1X tampone di lisi uno alla miscela per ottenere una soluzione di guanosina pentafosfato a quattro nanomolari. Utilizzando una pipetta multicanale e punte di pipette filtrate, mescolare 10 microlitri della miscela di guanosina pentafosfato con il lisato cellulare per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, lavare tre volte uno strumento a perno 96X in una soluzione allo 0,01% di detergente non ionico per 30 secondi, seguito da 30 secondi di asciugatura su un asciugamano di carta per lavaggio prima di posizionare lo strumento pin nella piastra campione a 96 pozzetti.
Dopo 30 secondi, sollevare l'utensile pin verso l'alto e posizionarlo direttamente su una membrana di nitrocellulosa per 30 secondi. Dopo cinque minuti di essiccazione, posizionare la membrana di nitrocellulosa in una cartella di plastica trasparente per l'esposizione allo schermo al fosforo di stoccaggio e la visualizzazione mediante imaging al fosforo, come dimostrato. Per quantificare e identificare potenziali proteine bersaglio, nel software di analisi associato all'imager del fosforo, aprire il file gel delle piastre visualizzate.
Per definire i punti da analizzare, utilizzare la funzione di analisi della matrice per impostare una griglia di 12 colonne per otto righe. Per circoscrivere il bordo esterno dei punti del foro, definite cerchi grandi, esportate il volume più lo sfondo e l'area dei grandi cerchi definiti in un foglio di calcolo. Per circoscrivere i piccoli punti interni, ridimensionare i cerchi definiti, esportare il volume più lo sfondo e l'area dei piccoli cerchi definiti e salvare tutti i dati nel foglio di calcolo.
Posiziona i cerchi in modo che si sovrappongano ai punti se necessario, ridimensionando i punti leggermente più grandi di quelli effettivi. Utilizzare l'equazione per calcolare le frazioni di associazione nel foglio di calcolo e tracciare i dati. Quindi identificare le potenziali proteine leganti nei pozzi che mostrano elevate frazioni di legame rispetto alla maggior parte degli altri pozzi.
In questa analisi rappresentativa, si può osservare una piastra con segnali di legame di fondo relativamente bassi nella maggior parte dei pozzi. Il segnale di legame positivo nel pozzo H3 ha mostrato una frazione di legame molto più alta di quella osservata per gli altri pozzetti a causa della sovraespressione della proteina legante la guanosina pentafosfato Hpt. Nelle placche rappresentative, diversi pozzi hanno mostrato segnali di legame di fondo relativamente più alti, come indicato dai punti interni relativamente forti osservati in molti pozzi, così come le frazioni di legame costantemente elevate osservate dopo la quantificazione.
In particolare, alcuni target hanno anche fornito frazioni di legame variabili, come i falsi positivi. Per chiarire ulteriormente, i ricercatori hanno utilizzato proteine purificate per testare nuovamente il legame. Una volta identificate le proteine bersaglio, è possibile purificarle in omogeneità e confermare la forza e la specificità dell'interazione utilizzando DRaCALA, calorimetria di titolazione isotermica o altri metodi.
L'identificazione delle proteine bersaglio di piccole molecole di segnalazione apre la strada a una comprensione approfondita dei ruoli che emergono dalla virulenza batterica alla biologia umana.
