Name: isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells
Uploaded: 2016-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01HL056046 PAL e K99HL116769 a AJT), e L&#39;Istituto di ricerca all&#39;ospedale dei bambini di Nationwide (PAL e AJT).

Etica Dichiarazione: Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute, ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzione Usa all&#39;ospedale dei bambini a livello nazionale. 1. Preparazione / Impostazione Nota: Questa tecnica di isolamento richiede due bobine di riscaldamento Langendorff posizionate fianco a fianco su un supporto ad anello, e collegato in parallelo ad un bagno di acqua circolante. <ol><li> Attiva bagno di acqua circolante e regolare la temperatura a una temperatura finale di 33-34 ° C sulla punta della cannula Langendorff (bagno acqua utilizzata in questa configurazione è impostato a 40 ° C a causa di una perdita di 6-7 ° C di temperatura attraverso tubi). Accendere le pompe di perfusione e impostare tasso di perfusione a 0,5 ml / min. <ol><li> Pulire entrambe le serpentine di riscaldamento con camicia d&#39;acqua, tubi allegato e 25 cannula calibro da vampate di calore ciascuno con 50 ml di etanolo al 70%, seguita da 100 ml di acqua ultrapura in autoclave. </li><li> Cancellare le serpentine di riscaldamentospingendo aria con una siringa e lavare con 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza rosso fenolo. Lasciare HBSS nelle serpentine di riscaldamento e tubi. </li><li> Attaccare sterile 10 ml luer-lock siringa riempita con temperatura ambiente HBSS senza rosso fenolo al tubo. Assicurarsi che non bolle d&#39;aria intrappolate all&#39;interno delle serpentine di tubi e di riscaldamento quando si collega la siringa HBSS-riempita in quanto ciò potrebbe causare embolia aria durante la digestione di un impatto negativo l&#39;isolamento VSMC. </li></ol></li><li> Rimuovere la cannula calibro 25 dalle serpentine di riscaldamento e posto su un altro sterile siringa da 10 ml pieno di ghiaccio-freddo HBSS senza rosso fenolo. Tenere questo in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Ripetere per l&#39;altra cannula. </li><li> Preparare Digestione enzimatica Solution. <ol><li> Pesare collagenasi di tipo 2 in base al numero di lotto specifico per 75 ml di soluzione di digestione per ottenere una concentrazione finale di 300 unità / ml. </li><li> Sciogliere collagenasi in 75 ml di HBSS con rosso fenolo. Successivamente, aggiungere 1,5 ml di 0.1 Mg / inibitore della tripsina di soia ml e 75 ml di 1 M CaCl 2 alla miscela. </li></ol></li><li> Se si utilizza immediatamente la soluzione di digestione, riscaldarlo a 37 ° C. In caso contrario, è posto a 4 ° C per un massimo di 6 ore. Questa soluzione deve essere fatto fresco ogni giorno. </li><li> Preparare il supporto soluzione di stop / placcatura. <ol><li> Aggiungere 100 ml inattivato al calore FBS, 5 ml di L-glutammina, 5 ml di aminoacidi non essenziali, 5 ml di HEPES, e 1 ml di primocin a 500 ml di glucosio (4,5 g / L) DMEM. Si raccomanda filtro di sterilizzazione. </li><li> Aliquota 6 ml di soluzione di stop in ciascuno dei dodici 15 ml provette coniche, numerati A1-A6 e B1-B6, e posto a 4 ° C. Aliquota 50 ml di soluzione di stop in una conica da 50 ml e posto nel 37 ° C incubatore. Nota: Questo passaggio può anche essere preparata il giorno prima l&#39;isolamento, se necessario. Questa soluzione di arresto sarà utilizzata come i mezzi di comunicazione di placcatura seguenti isolamento delle cellule. </li></ol></li><li> Preparare due 1 ml siringhe dotate di un ago G 30con 100 ml di eparina (1.000 unità / ml). </li><li> Tagliare un pezzo 5 cm di 5-0 seta chirurgica. Tie un nodo semplice allentato nella seta chirurgica con una estremità due volte finchè l&#39;altro. Posizionare sulla cannula 25-gauge, ma non stringere. Ripetere l&#39;operazione per l&#39;altro 25 G cannula. </li><li> Riempire quattro 35 mm piastre di Petri sterili (# 1-4) con 2 ml di sterili, ghiacciata, HBSS senza rosso fenolo. Tenere in ghiaccio. </li></ol> 2. L&#39;eutanasia, Isolamento Cuore e Incannulamento <ol><li> Prima di isolamento del cuore, in modo che la soluzione digestione e 50 ml conica della soluzione di stop sono caldi. Rimuovere la siringa HBSS-riempita con annesso 25 G cannula dal ghiaccio e posto in un morsetto buretta (o morsetto supporto ad anello) su un supporto ad anello. </li><li> Anestetizzare topo, utilizzando 3% isofluorane. Confermare il mouse è anestetizzato da un tocco dito su ogni arto posteriore. Se le contrazioni delle gambe, il mouse non è ancora anestetizzato in modo da attendere 1 minuto e ripetere il tocco con la punta. </li><li> Esporre la vena giugulare rimuovendo pelliccia unpelle nd sulla anteriore del collo con le forbici. Successivamente, utilizzare pinze per rimuovere accuratamente qualsiasi grasso che circonda la vena giugulare. Dopo la rimozione di grasso, iniettare lentamente 100 ml di eparina (1.000 unità / ml). Posizionare una spugna chirurgica sopra la vena al fine di evitare un eccessivo sanguinamento. </li><li> Dopo 1 minuto, a torace aperto per esporre il cuore, il cuore di sollevamento con pinze curve e delle accise che con le forbici, evitando di mettere l&#39;aorta ascendente intatta attraverso il primo ramo brachiocefalica. Immediatamente posto il cuore in un piatto 35 mm (1 #) con ghiaccio-freddo HBSS senza rosso fenolo e risciacquare. Nota: eseguire i seguenti 4 passaggi utilizzando un ambito dissezione. </li><li> Posizionare il 25 G cannula che è montato sull&#39;anello troviamo in un angolo di 45 ° in modo che la punta si trova appena sotto la superficie ghiacciata HBSS in piatto # 2 ed è chiaramente visibile attraverso il microscopio da dissezione. Trasferire il cuore di piatto # 2. </li><li> Utilizzando pinze Dumont, esporre l&#39;aorta, rimuovendo delicatamente eccesso adiposo via smussa di ppuntura revent o lacerazione dell&#39;aorta. Successivamente, utilizzare una pinza per far scorrere l&#39;aorta sopra la G cannula 25. </li><li> Guida la cannula verso il basso attraverso l&#39;aorta, vicino a, ma non oltre la valvola aortica, che compromettere l&#39;integrità della valvola e di conseguenza, la perfusione retrograda. Una volta che la cannula è a posto, far scorrere la seta pre-legato sopra l&#39;aorta, e stringere. Legare un secondo nodo per formare un nodo quadrato intorno all&#39;aorta per fissare il cuore. </li><li> Una volta che l&#39;aorta è legato in modo sicuro, lavare delicatamente il sangue rimanente dalla circolazione coronarica con il ghiaccio-freddo HBSS nella siringa attaccata alla cannula di G 25. Fare attenzione a non spingere troppo per evitare un&#39;eccessiva pressione coronarica. E &#39;richiesto solo un colore molto lento e delicato per completare il colore. incannulazione aortica senza perdite può essere osservato anche durante questo delicato filo. </li><li> Accendere la pompa di perfusione per iniziare il flusso di HBSS. Rimuovere il G cannula 25 (con il cuore in allegato) dalla siringa HBSS-riempita, avendo cura dimantenere il mozzo della cannula piena di HBSS, e collegarlo ai caldi serpentine di riscaldamento HBSS-riempite. Iniziare perfusione del cuore con la pompa di perfusione ad una velocità di 0,5 ml / min per 8 min. </li><li> Dopo il primo cuore è cannulata e viene perfuso sul sistema, ripetere i passaggi 2,1-2,8 per il secondo cuore. Questi isolamenti saranno scaglionati per ogni cuore quindi un&#39;attenta pianificazione e la tempistica sono necessari. </li></ol> 3. Digestione <ol><li> Dopo lavaggio con HBSS, cambiare lo 10 ml HBSS siringa attualmente sul pompa uno riempito con 10 ml di soluzione di digestione pre-riscaldato. Profumato ogni cuore con soluzione di digestione per 12 minuti ad una velocità di 0,5 ml / min. Non raccogliere frazioni derivanti da questa prima digestione come questo conterrà il sangue residuo e le cellule endoteliali. </li><li> Dopo 12 min, modificare la velocità di perfusione a 0,4 ml / min, posizionare una conica 15 ml (tubo A1 o B1, corrispondente al primo o secondo cuore per ogni digestione) riempito con solut arresto freddaione in un secchio di ghiaccio sotto il cuore, al fine di iniziare la raccolta perfusato VSMC arricchito. </li><li> Dopo 15 min, modificare la conica raccolta per tubo o tubo A2 B2 e centrifuga conica A1 e B1 a 89 xg per 10 min immediatamente dopo la raccolta di entrambe le frazioni. Quando la siringa riempita con la soluzione di digestione sulla pompa ha meno di 1 ml di soluzione, sostituirlo con un appena siringa preriempita 10 ml di soluzione di digestione. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante da ogni tubo di raccolta, lasciando circa 0,5 ml. Risospendere il pellet da A1 con 2 ml di soluzione di arresto calda (o supporto placcatura). Aggiungere risospensione dal tubo A1 a tubo B1 e luogo tubo nel 37 ° C incubatore con il tappo allentato. </li><li> Ripetere i punti 3.3 e 3.4 fino a quando tutti i tubi (attraverso la A6 e B6) sono utilizzati per un tempo di raccolta totale di 90 min. A 80 min di digestione, tagliare aprire l&#39;apice del cuore per scovare eventuali cellule che potrebbero essere intrappolate all&#39;interno del ventricolo e raccogliere queste cellule in A6 tubo e B6, faucibusctively. Nota: Di tanto in tanto il cuore cadrà la cannula prima del punto di tempo di 90 min. In questo caso, recuperare il cuore e posto in una sterile 35 millimetri piastra di Petri riempite con 2 ml di soluzione di digestione. Tagliare l&#39;apice del cuore e lavare delicatamente il cuore con soluzione di digestione. Poi, filtrare i 2 ml di soluzione di digestione attraverso una sterile 100 micron colino cella in una conica 50 ml e aggiungere alla A6 tubo o B6. </li><li> Dopo ogni giro di tubi successivi (A2 e B2), aggiungere le VSMC risospesa per il tubo di raccolta precedente (combinato A1 e B1). Inoltre, fare attenzione a non lasciare che la soluzione di digestione nella pompa esaurito e passare i 10 ml siringhe, se necessario durante la digestione. </li><li> Dopo che tutti i tubi sono combinati, centrifugare la sospensione ricco VSMC a 89 xg per 10 min. </li><li> Aspirare tanto surnatante dai tubi di raccolta il più possibile. Risospendere il pellet residuo in 2 ml di placcatura media e piatto su un piatto di coltura da 35 mm. Luogo cultura piatto hon 37 ° C incubatore per 24 ore. </li></ol> Cultura 4. cellulare Nota: Completare i passaggi rimanenti nel cabinet biosicurezza. <ol><li> Dopo 24 ore, aspirare delicatamente il supporto di placcatura. La cultura avrà normalmente una grande quantità di detriti. Per lavare le cellule, aggiungere 2 ml di caldo, PBS sterile e toccare delicatamente il piatto contro due dita durante la rotazione in senso orario. </li><li> Dopo la rotazione di 360 °, aspirare il PBS e ripetere una seconda volta. Aspirare il PBS e aggiungere un altro 2 ml di sterili, caldo PBS. Controllare il piatto cultura sotto il microscopio per assicurarsi che non vi è poca o nessuna detriti sulla piastra. Cellulare confluenza può essere determinato anche in questo momento. </li><li> Se i detriti rimane nel piatto cultura, ripetere il punto 4.2. Se il piatto cultura è privo di detriti, aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di terreni in piastra calda. </li><li> Dopo 24 ore, lavare le cellule di nuovo con il caldo, PBS sterile per rimuovere eventuali detriti finale o le cellule morte dalla cultura. Aspirare il PBS e ppizzo altri 2 ml di media placcatura calda sulle cellule. </li><li> Controllare sulle cellule ogni giorno e mangiare ogni 48 ore con i media placcatura riscaldati freschi. A questo punto, le cellule possono essere utilizzate per saggi standard di coltura cellulare. VSMC dovrebbero essere circa l&#39;80% confluenti 4-5 giorni dopo la placcatura, anche se può richiedere fino a 7 giorni fino a quando la procedura si perfeziona. Se la divisione di passaggi successivi, utilizzare un massimo di 1: 4 35 piatti mm (o in una zona comparabile di piatti della cultura). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Lo scopo di questo studio è stato quello di adattare i protocolli di isolamento delle cellule esistenti per aumentare la resa della coronaria liscia vascolare dai cuori murini. La maggior parte del lavoro pionieristico nella biologia vascolare muscolatura liscia è stata eseguita con le cellule muscolari lisce in coltura ratto aortica. Questi studi hanno fornito conoscenze fondamentali dei meccanismi molecolari che controllano la crescita VSMC, la migrazione e l&#39;ipertrofia 7. Tuttavia, come il campo prog...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di isolare le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica murino per l&#39;impiego in colture cellulari e saggi standard di coltura cellulare. Abbiamo sviluppato questa tecnica per valutare i meccanismi molecolari di rimodellamento vascolare nel diabete. Abbiamo precedentemente riportato verso l&#39;interno rimodellamento ipertrofico nelle arteriole coronariche del setto nel modello di topo db / db di diabete 1. A causa della limitata quantità di tessuto che si trova nelle coronarie setto murini, tecniche sperimentali standard di indagare variazioni proteiche (es Western blot) in topi db / db e controllo sono meno difficile. Inoltre, abbiamo già dimostrato che l&#39;antagonista del recettore dell&#39;angiotensina (ARB) losartan riduce il rimodellamento osservato nei topi db / db 2. Pertanto, l&#39;isolamento di VSMCs primarie dalla circolazione coronarica ci permette di indagare ulteriormente cambiamenti nel fenotipo VSMC o vie di segnalazione attivati ​​in topi diabetici, che possono essere contribuTing a negativo rimodellamento arteriole coronariche. Numerosi studi hanno chiarito vie di segnalazione canoniche utilizzando VSMC isolate da aorta di roditori, piuttosto che in ogni letto vascolare specifica. Tuttavia, abbiamo dimostrato vascolare letto rimodellamento specifico coronarica, aortica, e circolazioni mesenteriche di topi db / db 1, suggerendo le VSMC in ogni letto vascolare può essere diverso. Pertanto, è necessario isolare VSMC da ogni letto vascolare per comprendere meglio i cambiamenti patologici che si verificano in ciascun gruppo di VSMC. Ci sono una pletora di diversi metodi per isolare e coltura VSMCs aortica. Tuttavia, attualmente, vi è un solo studio che è stato pubblicato l&#39;isolamento di VSMC dal mouse circolazione coronarica 3. Teng et al. fu il primo a segnalare un metodo per isolare VSMCs dalla circolazione coronarica del mouse; tuttavia, abbiamo modificato in modo significativo il protocollo in quanto anche isolati cel endotelialeLS. Altri laboratori hanno anche utilizzato il protocollo da Teng et al. Isolare miociti arteriosi coronarici e delle vie aeree cellule muscolari lisce 4,5. Le alterazioni abbiamo incorporato produrrà una popolazione di cellule altamente arricchito per VSMCs dalla circolazione coronarica. La perfusione retrograda del cuore dei mammiferi isolato, o la tecnica Langendorff, è stata fondata nel 1897 da Oscar 6 Langendorff ed è ancora ampiamente usato oggi per l&#39;isolamento delle cellule cardiovascolari. La tecnica qui presentata, insieme con l&#39;avanzamento delle moderne modificazioni genetiche murine, fornisce uno strumento prezioso per studiare più da vicino il comportamento molecolare VSMCs dalla circolazione coronarica.

<table><tbody><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>Fisher</td><td>MT-25-060</td><td></td></tr><tr><td>Primocin - 20 ml</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA 10 mM 100x</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut 200 mM - Gibco</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Cell Strainer 100 &amp;micro;m nylon mesh</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td><td>Fisher</td><td>12-565-91</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td><td>Fisher</td><td>14-516-124</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type-2&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg</td><td>Sigma</td><td>T6522</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red)</td><td>Life Technologies</td><td>14170-161</td><td></td></tr><tr><td>5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td><td>Radnoti</td><td>158830</td><td></td></tr><tr><td>11 plus pump</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>Circulating heated water pump</td><td></td><td></td><td>any brand will work</td></tr></tbody></table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

Mentre l&#39;isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) da navi di grandi dimensioni è ben definito, abbiamo cercato di isolare e la cultura VSMC dalla circolazione coronarica. Cuori con archi aortici intatti sono stati rimossi e perfusi via Langendorff retrograda con una soluzione di digestione contenente 300 unità / ml di collagenasi di tipo II, 0,1 mg / inibitore della tripsina di soia ml e 1 M CaCl 2. Le perfusates sono stati raccolti a 15 min intervalli di 90 minuti, pellet per centrifugazione, risospese in terreni in piastra, e placcato su piatti di coltura di tessuti. VSMC sono stati caratterizzati da presenza di SM22α, α-SMA, e vimentina. Uno dei principali vantaggi di utilizzare questa tecnica è la capacità di isolare VSMC dalla circolazione coronarica di topi. Sebbene il piccolo numero di cellule ottenute possono limitare alcune delle applicazioni per le quali possono essere utilizzate le cellule, isolate VSMC coronarie può essere utilizzato in una varietà di tecniche di coltura cellulare consolidate e assays. Gli studi che indagano VSMC da topi geneticamente modificati in grado di fornire ulteriori informazioni sulla struttura-funzione e dei processi di segnalazione associati a patologie vascolari.

Grazie al nuovo aspetto della nostra tecnica di isolamento VSMC coronarica, abbiamo cercato di determinare la purezza del isolamento delle cellule. Mouse VSMC coronarici sono stati identificati in base alla loro morfologia e immunofluorescenza fino a passaggio 2. Sulla base della morfologia delle cellule in coltura dopo il primo lavaggio, la procedura di isolamento rimuove efficacemente miociti cardiaci e cellule endoteliali. Le VSMC mantengono la loro morfologia fino a passaggio 2 <stro...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l&#39;isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

isolation-of-murine-coronary-vascular-smooth-muscle-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  The Ohio State University College of Medicine.  Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l'isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard. 

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Isolation and Excision of Murine Aorta; A Versatile Technique in the Study of Cardiovascular Disease

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Isolamento e Asportazione di Murine Aorta; Una tecnica versatile nello studio delle malattie cardiovascolari

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated ...

Ricerca

Medicina

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolamento di cellule umane ombelicale muscolatura liscia arteriosa (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Biologia

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal muscles regulating the exchange of fluids and nutrients as well as the immune response against infectious agents by controlling immune cell migration. For these functions, MMEC form a functional &#34;myovascular unit&#34; (MVU), with further cell types, such as fibroblasts, pericytes and skeletal muscle cells. Consequently, a dysfunction of MMEC and therefore the MVU contributes to a vast variety of myopathies. However, regulatory mechanisms of MMEC in health and disease remain insufficiently understood and their elucidation precedes more specific treatments for myopathies. The isolation and in-depth investigation of primary MMEC functions in the context of the MVU might facilitate a better understanding of these processes.
This article provides a protocol to isolate primary murine MMEC of the skeletal muscle by mechanical and enzymatic dissociation including purification and culture maintenance steps.

Microvascular endothelial cells of skeletal muscles (MMEC) shape the inner wall of muscle capillaries and regulate both, exchange of fluids/molecules and migration of (immune) cells between muscle tissue and blood. Isolation of primary murine MMEC, as described here, enables comprehensive in vitro investigations of the &#34;myovascular unit&#34;.

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Neuroscienze

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolamento di microvascolare endoteliale tubi da arterie di resistenza mouse

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolamento di polmonare cellule muscolari lisce di topi neonati

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolamento e purificazione dei Periciti Cardiaci Murine

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Intrapulmonary Artery and Smooth Muscle Cells to Investigate Vascular Responses

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of vasoconstriction and vasorelaxation. After isolating the IPA and VSMCs, the characteristics of vascular responses in physiological and pathological conditions can be assessed in the absence of extrinsic factors such as nerve signals, hormones, cytokines, etc. Thus, the IPA and VSMCs serve as excellent models for studying vascular physiology/pathophysiology, along with various experimental investigations, such as modulation by pharmacological agents, patch-clamp electrophysiological analysis, calcium imaging, etc. Here, we have used a technique for isolating the IPA to investigate vascular responses in an organ bath setup. IPA segments were mounted on the organ bath chamber via intraluminal wires and stimulated by various pharmacological agents. The changes in IPA vascular tone (i.e., vasoconstriction and vasorelaxation), were recorded using an isometric force transducer and physiological data analysis software program. We implemented several experimental protocols, which can be adapted to investigate the mechanisms of vasorelaxation/vasoconstriction for studying the pharmacological activities of phytochemical or synthetic drugs. The protocols can also be used to evaluate drugs&#39; roles in modulating various diseases, including pulmonary arterial hypertension. The IPA model allows us to investigate the concentration-response curve, which is crucial in assessing drugs&#39; pharmacodynamic parameters.

Vascular responses of arterial pulmonary circulation can be explored using intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs). The present study describes the isolation of IPA in detail and the protocols used for investigating vasorelaxation in response to physiological stimuli.

Isolamento dell'arteria intrapolmonare e delle cellule muscolari lisce per studiare le risposte vascolari

The intrapulmonary artery (IPA) and vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated from rat lungs can be used to study the underlying mechanisms of ...

Isolamento e separazione magnetica di cellule staminali CD34+ murine dalla parete vascolare

Immunomagnetic Isolation of the Vascular Wall-Resident CD34+ Stem Cells from Mice

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury and repair. Establishing a stable and efficient method to culture functional murine CD34+ VW-SCs is essential for further investigating the mechanisms involved in the proliferation, migration, and differentiation of these cells under various physiological and pathological conditions. The described method combines magnetic bead screening and flow cytometry to purify primary cultured resident CD34+ VW-SCs. The purified cells are then functionally identified through immunofluorescence staining and Ca2+ imaging. Briefly, vascular cells from the adventitia of the murine aorta and mesenteric artery are obtained through tissue block attachment, followed by subculturing until reaching a cell count of at least 1 &#215; 107. Subsequently, CD34+ VW-SCs are purified using magnetic bead sorting and flow cytometry. Identification of CD34+ VW-SCs involves cellular immunofluorescence staining, while functional multipotency is determined by exposing cells to a specific culture medium for oriented differentiation. Moreover, functional internal Ca2+ release and external Ca2+ entry is assessed using a commercially available imaging workstation in Fura-2/AM-loaded cells exposed to ATP, caffeine, or thapsigargin (TG). This method offers a stable and efficient technique for isolating, culturing, and identifying vascular wall-resident CD34+ stem cells, providing an opportunity for in vitro studies on the regulatory mechanisms of VW-SCs and the screening of targeted drugs.

Autore in primo piano: Isolamento e caratterizzazione migliorati delle cellule staminali CD34+ murine residenti nella parete vascolare utilizzando la citometria a flusso accoppiata a screen

This study has established a stable and efficient method for the isolation, culture, and functional determination of vascular wall-resident CD34+ stem cells (CD34+ VW-SCs). This easy-to-follow and time-effective isolation method can be utilized by other investigators to study the potential mechanisms involved in cardiovascular diseases.

Isolamento immunomagnetico delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare dai topi

Resident CD34+ vascular wall-resident stem and progenitor cells (VW-SCs) are increasingly recognized for their crucial role in regulating vascular injury ...

L'isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

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