Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01HL056046 PAL e K99HL116769 a AJT), e L&#39;Istituto di ricerca all&#39;ospedale dei bambini di Nationwide (PAL e AJT).

Etica Dichiarazione: Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute, ed è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzione Usa all&#39;ospedale dei bambini a livello nazionale. 1. Preparazione / Impostazione Nota: Questa tecnica di isolamento richiede due bobine di riscaldamento Langendorff posizionate fianco a fianco su un supporto ad anello, e collegato in parallelo ad un bagno di acqua circolante. <ol><li> Attiva bagno di acqua circolante e regolare la temperatura a una temperatura finale di 33-34 ° C sulla punta della cannula Langendorff (bagno acqua utilizzata in questa configurazione è impostato a 40 ° C a causa di una perdita di 6-7 ° C di temperatura attraverso tubi). Accendere le pompe di perfusione e impostare tasso di perfusione a 0,5 ml / min. <ol><li> Pulire entrambe le serpentine di riscaldamento con camicia d&#39;acqua, tubi allegato e 25 cannula calibro da vampate di calore ciascuno con 50 ml di etanolo al 70%, seguita da 100 ml di acqua ultrapura in autoclave. </li><li> Cancellare le serpentine di riscaldamentospingendo aria con una siringa e lavare con 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) senza rosso fenolo. Lasciare HBSS nelle serpentine di riscaldamento e tubi. </li><li> Attaccare sterile 10 ml luer-lock siringa riempita con temperatura ambiente HBSS senza rosso fenolo al tubo. Assicurarsi che non bolle d&#39;aria intrappolate all&#39;interno delle serpentine di tubi e di riscaldamento quando si collega la siringa HBSS-riempita in quanto ciò potrebbe causare embolia aria durante la digestione di un impatto negativo l&#39;isolamento VSMC. </li></ol></li><li> Rimuovere la cannula calibro 25 dalle serpentine di riscaldamento e posto su un altro sterile siringa da 10 ml pieno di ghiaccio-freddo HBSS senza rosso fenolo. Tenere questo in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. Ripetere per l&#39;altra cannula. </li><li> Preparare Digestione enzimatica Solution. <ol><li> Pesare collagenasi di tipo 2 in base al numero di lotto specifico per 75 ml di soluzione di digestione per ottenere una concentrazione finale di 300 unità / ml. </li><li> Sciogliere collagenasi in 75 ml di HBSS con rosso fenolo. Successivamente, aggiungere 1,5 ml di 0.1 Mg / inibitore della tripsina di soia ml e 75 ml di 1 M CaCl 2 alla miscela. </li></ol></li><li> Se si utilizza immediatamente la soluzione di digestione, riscaldarlo a 37 ° C. In caso contrario, è posto a 4 ° C per un massimo di 6 ore. Questa soluzione deve essere fatto fresco ogni giorno. </li><li> Preparare il supporto soluzione di stop / placcatura. <ol><li> Aggiungere 100 ml inattivato al calore FBS, 5 ml di L-glutammina, 5 ml di aminoacidi non essenziali, 5 ml di HEPES, e 1 ml di primocin a 500 ml di glucosio (4,5 g / L) DMEM. Si raccomanda filtro di sterilizzazione. </li><li> Aliquota 6 ml di soluzione di stop in ciascuno dei dodici 15 ml provette coniche, numerati A1-A6 e B1-B6, e posto a 4 ° C. Aliquota 50 ml di soluzione di stop in una conica da 50 ml e posto nel 37 ° C incubatore. Nota: Questo passaggio può anche essere preparata il giorno prima l&#39;isolamento, se necessario. Questa soluzione di arresto sarà utilizzata come i mezzi di comunicazione di placcatura seguenti isolamento delle cellule. </li></ol></li><li> Preparare due 1 ml siringhe dotate di un ago G 30con 100 ml di eparina (1.000 unità / ml). </li><li> Tagliare un pezzo 5 cm di 5-0 seta chirurgica. Tie un nodo semplice allentato nella seta chirurgica con una estremità due volte finchè l&#39;altro. Posizionare sulla cannula 25-gauge, ma non stringere. Ripetere l&#39;operazione per l&#39;altro 25 G cannula. </li><li> Riempire quattro 35 mm piastre di Petri sterili (# 1-4) con 2 ml di sterili, ghiacciata, HBSS senza rosso fenolo. Tenere in ghiaccio. </li></ol> 2. L&#39;eutanasia, Isolamento Cuore e Incannulamento <ol><li> Prima di isolamento del cuore, in modo che la soluzione digestione e 50 ml conica della soluzione di stop sono caldi. Rimuovere la siringa HBSS-riempita con annesso 25 G cannula dal ghiaccio e posto in un morsetto buretta (o morsetto supporto ad anello) su un supporto ad anello. </li><li> Anestetizzare topo, utilizzando 3% isofluorane. Confermare il mouse è anestetizzato da un tocco dito su ogni arto posteriore. Se le contrazioni delle gambe, il mouse non è ancora anestetizzato in modo da attendere 1 minuto e ripetere il tocco con la punta. </li><li> Esporre la vena giugulare rimuovendo pelliccia unpelle nd sulla anteriore del collo con le forbici. Successivamente, utilizzare pinze per rimuovere accuratamente qualsiasi grasso che circonda la vena giugulare. Dopo la rimozione di grasso, iniettare lentamente 100 ml di eparina (1.000 unità / ml). Posizionare una spugna chirurgica sopra la vena al fine di evitare un eccessivo sanguinamento. </li><li> Dopo 1 minuto, a torace aperto per esporre il cuore, il cuore di sollevamento con pinze curve e delle accise che con le forbici, evitando di mettere l&#39;aorta ascendente intatta attraverso il primo ramo brachiocefalica. Immediatamente posto il cuore in un piatto 35 mm (1 #) con ghiaccio-freddo HBSS senza rosso fenolo e risciacquare. Nota: eseguire i seguenti 4 passaggi utilizzando un ambito dissezione. </li><li> Posizionare il 25 G cannula che è montato sull&#39;anello troviamo in un angolo di 45 ° in modo che la punta si trova appena sotto la superficie ghiacciata HBSS in piatto # 2 ed è chiaramente visibile attraverso il microscopio da dissezione. Trasferire il cuore di piatto # 2. </li><li> Utilizzando pinze Dumont, esporre l&#39;aorta, rimuovendo delicatamente eccesso adiposo via smussa di ppuntura revent o lacerazione dell&#39;aorta. Successivamente, utilizzare una pinza per far scorrere l&#39;aorta sopra la G cannula 25. </li><li> Guida la cannula verso il basso attraverso l&#39;aorta, vicino a, ma non oltre la valvola aortica, che compromettere l&#39;integrità della valvola e di conseguenza, la perfusione retrograda. Una volta che la cannula è a posto, far scorrere la seta pre-legato sopra l&#39;aorta, e stringere. Legare un secondo nodo per formare un nodo quadrato intorno all&#39;aorta per fissare il cuore. </li><li> Una volta che l&#39;aorta è legato in modo sicuro, lavare delicatamente il sangue rimanente dalla circolazione coronarica con il ghiaccio-freddo HBSS nella siringa attaccata alla cannula di G 25. Fare attenzione a non spingere troppo per evitare un&#39;eccessiva pressione coronarica. E &#39;richiesto solo un colore molto lento e delicato per completare il colore. incannulazione aortica senza perdite può essere osservato anche durante questo delicato filo. </li><li> Accendere la pompa di perfusione per iniziare il flusso di HBSS. Rimuovere il G cannula 25 (con il cuore in allegato) dalla siringa HBSS-riempita, avendo cura dimantenere il mozzo della cannula piena di HBSS, e collegarlo ai caldi serpentine di riscaldamento HBSS-riempite. Iniziare perfusione del cuore con la pompa di perfusione ad una velocità di 0,5 ml / min per 8 min. </li><li> Dopo il primo cuore è cannulata e viene perfuso sul sistema, ripetere i passaggi 2,1-2,8 per il secondo cuore. Questi isolamenti saranno scaglionati per ogni cuore quindi un&#39;attenta pianificazione e la tempistica sono necessari. </li></ol> 3. Digestione <ol><li> Dopo lavaggio con HBSS, cambiare lo 10 ml HBSS siringa attualmente sul pompa uno riempito con 10 ml di soluzione di digestione pre-riscaldato. Profumato ogni cuore con soluzione di digestione per 12 minuti ad una velocità di 0,5 ml / min. Non raccogliere frazioni derivanti da questa prima digestione come questo conterrà il sangue residuo e le cellule endoteliali. </li><li> Dopo 12 min, modificare la velocità di perfusione a 0,4 ml / min, posizionare una conica 15 ml (tubo A1 o B1, corrispondente al primo o secondo cuore per ogni digestione) riempito con solut arresto freddaione in un secchio di ghiaccio sotto il cuore, al fine di iniziare la raccolta perfusato VSMC arricchito. </li><li> Dopo 15 min, modificare la conica raccolta per tubo o tubo A2 B2 e centrifuga conica A1 e B1 a 89 xg per 10 min immediatamente dopo la raccolta di entrambe le frazioni. Quando la siringa riempita con la soluzione di digestione sulla pompa ha meno di 1 ml di soluzione, sostituirlo con un appena siringa preriempita 10 ml di soluzione di digestione. </li><li> Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante da ogni tubo di raccolta, lasciando circa 0,5 ml. Risospendere il pellet da A1 con 2 ml di soluzione di arresto calda (o supporto placcatura). Aggiungere risospensione dal tubo A1 a tubo B1 e luogo tubo nel 37 ° C incubatore con il tappo allentato. </li><li> Ripetere i punti 3.3 e 3.4 fino a quando tutti i tubi (attraverso la A6 e B6) sono utilizzati per un tempo di raccolta totale di 90 min. A 80 min di digestione, tagliare aprire l&#39;apice del cuore per scovare eventuali cellule che potrebbero essere intrappolate all&#39;interno del ventricolo e raccogliere queste cellule in A6 tubo e B6, faucibusctively. Nota: Di tanto in tanto il cuore cadrà la cannula prima del punto di tempo di 90 min. In questo caso, recuperare il cuore e posto in una sterile 35 millimetri piastra di Petri riempite con 2 ml di soluzione di digestione. Tagliare l&#39;apice del cuore e lavare delicatamente il cuore con soluzione di digestione. Poi, filtrare i 2 ml di soluzione di digestione attraverso una sterile 100 micron colino cella in una conica 50 ml e aggiungere alla A6 tubo o B6. </li><li> Dopo ogni giro di tubi successivi (A2 e B2), aggiungere le VSMC risospesa per il tubo di raccolta precedente (combinato A1 e B1). Inoltre, fare attenzione a non lasciare che la soluzione di digestione nella pompa esaurito e passare i 10 ml siringhe, se necessario durante la digestione. </li><li> Dopo che tutti i tubi sono combinati, centrifugare la sospensione ricco VSMC a 89 xg per 10 min. </li><li> Aspirare tanto surnatante dai tubi di raccolta il più possibile. Risospendere il pellet residuo in 2 ml di placcatura media e piatto su un piatto di coltura da 35 mm. Luogo cultura piatto hon 37 ° C incubatore per 24 ore. </li></ol> Cultura 4. cellulare Nota: Completare i passaggi rimanenti nel cabinet biosicurezza. <ol><li> Dopo 24 ore, aspirare delicatamente il supporto di placcatura. La cultura avrà normalmente una grande quantità di detriti. Per lavare le cellule, aggiungere 2 ml di caldo, PBS sterile e toccare delicatamente il piatto contro due dita durante la rotazione in senso orario. </li><li> Dopo la rotazione di 360 °, aspirare il PBS e ripetere una seconda volta. Aspirare il PBS e aggiungere un altro 2 ml di sterili, caldo PBS. Controllare il piatto cultura sotto il microscopio per assicurarsi che non vi è poca o nessuna detriti sulla piastra. Cellulare confluenza può essere determinato anche in questo momento. </li><li> Se i detriti rimane nel piatto cultura, ripetere il punto 4.2. Se il piatto cultura è privo di detriti, aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di terreni in piastra calda. </li><li> Dopo 24 ore, lavare le cellule di nuovo con il caldo, PBS sterile per rimuovere eventuali detriti finale o le cellule morte dalla cultura. Aspirare il PBS e ppizzo altri 2 ml di media placcatura calda sulle cellule. </li><li> Controllare sulle cellule ogni giorno e mangiare ogni 48 ore con i media placcatura riscaldati freschi. A questo punto, le cellule possono essere utilizzate per saggi standard di coltura cellulare. VSMC dovrebbero essere circa l&#39;80% confluenti 4-5 giorni dopo la placcatura, anche se può richiedere fino a 7 giorni fino a quando la procedura si perfeziona. Se la divisione di passaggi successivi, utilizzare un massimo di 1: 4 35 piatti mm (o in una zona comparabile di piatti della cultura). </li></ol>

<ol>
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W., Hort, W., Lichti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diameter+of+coronary+arteries+in+36+species+of+mammalian+from+mouse+to+giraffe.">Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe.</a> Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Lo scopo di questo studio è stato quello di adattare i protocolli di isolamento delle cellule esistenti per aumentare la resa della coronaria liscia vascolare dai cuori murini. La maggior parte del lavoro pionieristico nella biologia vascolare muscolatura liscia è stata eseguita con le cellule muscolari lisce in coltura ratto aortica. Questi studi hanno fornito conoscenze fondamentali dei meccanismi molecolari che controllano la crescita VSMC, la migrazione e l&#39;ipertrofia 7. Tuttavia, come il campo prog...

L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di isolare le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica murino per l&#39;impiego in colture cellulari e saggi standard di coltura cellulare. Abbiamo sviluppato questa tecnica per valutare i meccanismi molecolari di rimodellamento vascolare nel diabete. Abbiamo precedentemente riportato verso l&#39;interno rimodellamento ipertrofico nelle arteriole coronariche del setto nel modello di topo db / db di diabete 1. A causa della limitata quantità di tessuto che si trova nelle coronarie setto murini, tecniche sperimentali standard di indagare variazioni proteiche (es Western blot) in topi db / db e controllo sono meno difficile. Inoltre, abbiamo già dimostrato che l&#39;antagonista del recettore dell&#39;angiotensina (ARB) losartan riduce il rimodellamento osservato nei topi db / db 2. Pertanto, l&#39;isolamento di VSMCs primarie dalla circolazione coronarica ci permette di indagare ulteriormente cambiamenti nel fenotipo VSMC o vie di segnalazione attivati ​​in topi diabetici, che possono essere contribuTing a negativo rimodellamento arteriole coronariche. Numerosi studi hanno chiarito vie di segnalazione canoniche utilizzando VSMC isolate da aorta di roditori, piuttosto che in ogni letto vascolare specifica. Tuttavia, abbiamo dimostrato vascolare letto rimodellamento specifico coronarica, aortica, e circolazioni mesenteriche di topi db / db 1, suggerendo le VSMC in ogni letto vascolare può essere diverso. Pertanto, è necessario isolare VSMC da ogni letto vascolare per comprendere meglio i cambiamenti patologici che si verificano in ciascun gruppo di VSMC. Ci sono una pletora di diversi metodi per isolare e coltura VSMCs aortica. Tuttavia, attualmente, vi è un solo studio che è stato pubblicato l&#39;isolamento di VSMC dal mouse circolazione coronarica 3. Teng et al. fu il primo a segnalare un metodo per isolare VSMCs dalla circolazione coronarica del mouse; tuttavia, abbiamo modificato in modo significativo il protocollo in quanto anche isolati cel endotelialeLS. Altri laboratori hanno anche utilizzato il protocollo da Teng et al. Isolare miociti arteriosi coronarici e delle vie aeree cellule muscolari lisce 4,5. Le alterazioni abbiamo incorporato produrrà una popolazione di cellule altamente arricchito per VSMCs dalla circolazione coronarica. La perfusione retrograda del cuore dei mammiferi isolato, o la tecnica Langendorff, è stata fondata nel 1897 da Oscar 6 Langendorff ed è ancora ampiamente usato oggi per l&#39;isolamento delle cellule cardiovascolari. La tecnica qui presentata, insieme con l&#39;avanzamento delle moderne modificazioni genetiche murine, fornisce uno strumento prezioso per studiare più da vicino il comportamento molecolare VSMCs dalla circolazione coronarica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">HEPES 1M solution</td>
			<td style="width:143px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">MT-25-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Primocin - 20mL</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-pm-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM NEAA 10 mM 100X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glut 200 mM - Gibco</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22363549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-565-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Apparatus black silk suture 5-0</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-516-124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase Type-2&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Soybean Trypsin Inhibitor 25mg</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red)</td>
			<td style="width:143px;">Life Technologies</td>
			<td>14170-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5.0 ml heating coil with degassing bubble trap</td>
			<td>Radnoti</td>
			<td>158830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">11 plus pump</td>
			<td style="width:143px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">70-2208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Circulating heated water pump</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>any brand will work</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine coronary vascular smooth muscle cells

Mentre l&#39;isolamento e la coltura di cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) da navi di grandi dimensioni è ben definito, abbiamo cercato di isolare e la cultura VSMC dalla circolazione coronarica. Cuori con archi aortici intatti sono stati rimossi e perfusi via Langendorff retrograda con una soluzione di digestione contenente 300 unità / ml di collagenasi di tipo II, 0,1 mg / inibitore della tripsina di soia ml e 1 M CaCl 2. Le perfusates sono stati raccolti a 15 min intervalli di 90 minuti, pellet per centrifugazione, risospese in terreni in piastra, e placcato su piatti di coltura di tessuti. VSMC sono stati caratterizzati da presenza di SM22α, α-SMA, e vimentina. Uno dei principali vantaggi di utilizzare questa tecnica è la capacità di isolare VSMC dalla circolazione coronarica di topi. Sebbene il piccolo numero di cellule ottenute possono limitare alcune delle applicazioni per le quali possono essere utilizzate le cellule, isolate VSMC coronarie può essere utilizzato in una varietà di tecniche di coltura cellulare consolidate e assays. Gli studi che indagano VSMC da topi geneticamente modificati in grado di fornire ulteriori informazioni sulla struttura-funzione e dei processi di segnalazione associati a patologie vascolari.

Grazie al nuovo aspetto della nostra tecnica di isolamento VSMC coronarica, abbiamo cercato di determinare la purezza del isolamento delle cellule. Mouse VSMC coronarici sono stati identificati in base alla loro morfologia e immunofluorescenza fino a passaggio 2. Sulla base della morfologia delle cellule in coltura dopo il primo lavaggio, la procedura di isolamento rimuove efficacemente miociti cardiaci e cellule endoteliali. Le VSMC mantengono la loro morfologia fino a passaggio 2 <stro...

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Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l&#39;isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Views.  The Ohio State University College of Medicine.  Lo scopo di questo protocollo è quello di dimostrare l'isolamento e coltura tecniche di cellule muscolari murine primarie lisce vascolari (VSMC) dalla circolazione coronarica. Una volta VSMC sono stati isolati, essi possono essere utilizzati per vari tecniche di coltura standard. 

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolamento di cellule umane ombelicale muscolatura liscia arteriosa (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

Isolamento e la differenziazione di cellule stromali vascolari alle celle Beige / Brite

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Isolamento di polmonare cellule muscolari lisce di topi neonati

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolamento di cellule di topo coronarica endoteliali

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Lesione aortica di crusca a murina: un efficace<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di proliferazione cellulare liscia e funzione endoteliale

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...