Gli autori desiderano ringraziare Tiffany Cherry nel suo aiuto per ottimizzare questo protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Aging (AG032320) così come Avanzando un più sano Wisconsin.

Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema di base della procedura a partire con l&#39;omogeneizzato. Tempo stimato dalla preparazione di estratti cellulari a eluizione di Cam-bound proteine ​​è di circa 6-7 ore. 1. Preparazione del tessuto <ol><li> Iniettare organotipica fettine di ippocampo con un virus che contiene un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse (in questo esempio, proteina fluorescente verde (GFP)-tagged Ng) e permettono di esprimere la proteina dei tessuti durante la notte. </li><li> Circa 12 a 18 ore dopo l&#39;iniezione virale (a seconda del tempo di espressione virale), si preparano a raccogliere i tessuti. Aggiungere 1 ml di buffer dissezione (glucosio 10mM, KCl 4 mm, 26mm NaHCO3, saccarosio 233mM, 5mm MgCl 2, 1 mM CaCl 2, e 0,1% di fenolo-rosso, gasati con il 5% di CO 2 95% O 2) a una piastra di Petri. Trasferimento dei tessuti in coltura / inserto a Petri e aggiungere 2 ml di buffer dissezione, per l&#39;inserto di immergere il tessuto. </li><li> Raccoltat organotipica tessuto dell&#39;ippocampo (tra 5 e 10 fette) con delicatezza raschiando il tessuto libero della membrana inserire utilizzando un bisturi. In particolare la rimozione di una particolare regione di interesse (ad esempio CA1) è anche un&#39;opzione. Trasferire la sospensione di tessuto in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml utilizzando una pipetta Pasteur invertita. </li><li> Centrifugare i campioni a 1.500 rcf per 1 min per separare i tessuti dal buffer dissezione. Rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Assicurarsi di non disturbare il pellet. </li><li> Per ogni fetta utilizzato, aggiungere 30-60 ml di buffer di omogeneizzazione (150mm NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 1mM DTT, 1μg/mL leupeptina, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antidolore, pepstatina 1μg/mL, e l&#39;1% Triton X -100) al tessuto e omogeneizzare accuratamente con pestello. </li><li> Al fine di rimuovere i detriti cellulari, centrifugare la omogenato restante a 1.100 rcf per 10 minuti e rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione evitando la contaminazione da pellet. </li><li> Prendere il 10% del supernatante come un campione di input (esempio 1). Conservare il surnatante rimanente sul ghiaccio durante la preparazione del CAM-sefarosio perle per l&#39;utilizzo al punto 3. </li></ol> Nota: Il tessuto usato qui sono organotipica fettine di ippocampo. Tuttavia, si potrebbero usare i neuroni dissociati o qualsiasi altro sistema di coltura cellulare. In tal caso, iniziare a passo 1,4 dopo aver raccolto il fazzoletto di carta nel modo appropriato. 2. Preparazione di perline per pull-down Nel maneggiare le perline, è importante per salvare le perline e massimizzare l&#39;efficienza delle reazioni, impedendo le perline si secchi ai lati del tubo. Per fare questo, è meglio ruotare il tubo dalla loro parte, permettendo la soluzione per bagnare le perline sulle pareti del tubo, immediatamente prima della centrifugazione. <ol><li> Per ogni pull-down, pipetta 400 ml di sospensione Calmodulina-Sepharose perle in una provetta 2 mL con un relativamente flat-basso per massimizzare la superficie e l&#39;interazione delle soluzioni con le perline durante il vostro incubazione. </li><li> Centrifugare perline a 21.000 rcf per 30 secondi e rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione. Assicurarsi di non disturbare le perline. </li><li> Per lavare le perline, aggiungere 100 ml di buffer di omogeneizzazione rispettivi contenente 2 mM CaCl 2 a quelli utilizzati per pull-down Ca 2 +-CaM proteine ​​di legame e 2 mM EDTA (un chelante del noto Ca 2 +) per perline abbattimento proteine ​​ApoCaM vincolanti. Battere delicatamente la provetta per risospendere perline e centrifugare a 1500 rcf per 1 min. Rimuovere con attenzione il surnatante tramite aspirazione, facendo attenzione a non disturbare le perline. </li></ol> Nota: per tutte le fasi di aspirazione, si raccomanda di usare un puntale che ha una apertura multa (ad esempio punte di carico gel) per permettere la rimozione della soluzione senza rimuovere perline. 3. CaM-sefarosio legame delle proteine <ol><li> Dividere il surnatante in due condizioni che contiene un uguale volume. A seconda del vostro stato, aggiungere la giusta quantità di CaCl 2 o EDTA al surnatante fino a 2 mm per ogni concentrazione. </li><li> Aggiungi surnatante dal passo 1,7 a perline lavati in buffer di omogeneizzazione corrispondente. Battere delicatamente il tubo per mescolare. </li><li> Incubare i campioni a 4 ° C per 3 ore su un agitatore. Risospendere perline ogni 30 minuti o giù di lì per aumentare l&#39;efficienza di legame. </li><li> Provetta da centrifuga contenente campioni e perline a 1500 rcf per 3 min. </li><li> Prendere 50μL di surnatante come un campione di proteina non legata (campione 2) e rimuovere con attenzione il surnatante per aspirazione e scartare. </li><li> Lavare perle tre volte come descritto al punto 2.3 Uso 100μL di buffer di omogeneizzazione rispettivi proprietari. </li></ol> 4. Eluizione <ol><li> Aggiungere 50μL di tampone di eluizione (50mM Tris-HCl pH 7,5 e 150mm NaCl) contenente la condizione opposta (10mM Cacl 2 o 10mM EDTA) ai talloni. Per esempio, i campioni che sono stati omogeneizzati e legato in tampone contenente Ca 2 + vengono eluiti secondo tampone di eluizione contenente EDTA e viceversa. </li></ol> Opzionale: Il riscaldamento del tampone di eluizione di 37 ° C prima di aggiungere al perline può aumentare il rendimento. <ol start="2"><li> Incubare soluzione con perline a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore. Mescolare le perle picchiettando delicatamente il tubo circa ogni 5 min. </li><li> Centrifugare perline a 1.500 rcf per 3 minuti e rimuovere con attenzione il 50μL di supernatante per il legato alle proteine ​​(campione 3) per aspirazione. Assicurarsi di non disturbare le perline. </li><li> Aggiungi il caricamento del buffer proteine ​​a tutti i campioni (ad esempio proteine ​​omogenato, liberi e legati così come quelle ancora legato ai talloni). </li></ol> Nota: Per massimizzare eluizione (specialmente nel caso di eluizione inefficienti), aggiungere 50μL del buffer di eluizione corrispondente (ad esempio l&#39;aggiunta di buf contenente EDTAfer di perle legate in CaCl 2) per le perle di riscaldamento prima di campioni per eluire le proteine ​​rimanenti legato e ripetere i passaggi descritti in 4,3 per rimuovere le proteine ​​legate rimanenti. 5. SDS-PAGE e Western Blot Condotta SDS-PAGE e analizzare usando western blot sondando per la proteina di interesse e di sonda per una proteina nota per legare CaM nella condizione opposta come controllo positivo. 6. Rappresentante Risultati Figura 2B mostra un esempio di Cam-pull-down test di prova il legame di CaM GFP-tagged Ng rispetto al Ng endogena. Per farlo, GFP-Ng è stato sovra-espresso nei nostri organotipica fettine ippocampali durante la notte e il tessuto è stato omogeneizzato. L&#39;omogenato è stato incubato con CaM-sefarosio perline in presenza di entrambi i Ca 2 + o EDTA. Ingresso omogenato mostra che la GFP-Ng è stato espresso oltre che endogene Ng e Ca 2 + / CaM chinasi-dipendenti II(CaMKII). Come previsto in base al legame noto di Ng endogeni (illustrato nella fig. 2A), GFP-tagged Ng è stato eluito in assenza di Ca 2 + (proteina legata EDTA) e non legato alla presenza di Ca 2 + (Fig. 2B) . Al contrario, il controllo, CaMKII, è stato eluito solo in presenza di Ca 2 + (legato alle proteine) ed è stato legato in sua assenza (EDTA). Questo dimostra che le perline CaM erano funziona bene e il elutions erano efficienti. Ancora più importante, questo dimostra che GFP-Ng si lega a ApoCaM in modo simile alla forma endogena, suggerendo che il tag GFP non ha alterato la funzione della nostra proteina ricombinante. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Schema di CaM pull-down assay (A) omogenato del tessuto è filato giù per rimuovere i detriti cellulari. Circa il 10% del surnatante è preso come un esempio di ingresso (1). Il surnatante rimanente viene diviso in parti uguali per i diversicondizioni ed i reagenti appropriati (CaCl 2 o EDTA) vengono aggiunti alla prova vincolante in quelle condizioni. Ogni surnatante (contenente CaCl 2 o EDTA) viene caricato sulla rispettivamente preparato CaM-sefarosio perline e (B) incubato per consentire vincolanti. Proteine ​​non legate vengono rimossi (2) e (C) le proteine ​​legate (3) vengono eluiti fuori delle perle utilizzando tampone di eluizione (EB) contenente la condizione opposta, come l&#39;associazione. La composizione proteica di questi tre campioni di proteine ​​possono essere analizzati mediante SDS-PAGE e analisi Western Blot. <img src="/files/ftp_upload/3502/3502fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A.) Schema di Ca 2 +-dipendente vincolante CaM e eluizione di pull-down Esempi dosaggio sono dati di due tipi di proteine ​​che legano CaM in Ca 2 +-dipendente. Neurogranin (Ng) rappresenta proteine ​​che si legano apo-CAM e CaMKII rappresenta proteine ​​che si legano a Ca 2 + ricchiCaM. CaM è mostrato nel suo stato dissociato prima dell&#39;incubazione con le proteine ​​omogenato. Una volta incubate in condizioni di alte concentrazioni di Ca 2 + (2 mm) o in presenza di un chelante del Ca 2 +, EDTA (2 mm), le proteine ​​si legano a CaM di conseguenza. Ng lega CaM nella condizione EDTA come non vi è poca o nessuna Ca 2 + presenti, e sarebbe eluiti fuori dal Cam-sefarosio perline in presenza di Ca 2 +. CaMKII, tuttavia, si legano ai CaM in presenza di elevate quantità di Ca 2 + e si dissociano una volta che il Ca 2 + è stato chelati. B) I risultati di CaM esempio di pull-down test. Questo dato dimostra il risultato finale atteso di un Cam-sefarosio tirare giù con i campioni sondato per Ng e CaMKII. Sia il endogene Ng e GFP-Ng sono presenti nelle corsie di proteine ​​legate a CaM in presenza di EDTA. Ng non è legato quando i campioni sono incubati con CaM in presenza di Ca 2 +, a dimostrazione che Ng lega solo apo-CAM. Il nostro controllo positivo, CaMKII, invece, si lega alla CaM solo in presenza di Ca 2 +.

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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+plays+a+pivotal+role+in+cellular+regulation.">Calmodulin plays a pivotal role in cellular regulation.</a> Science. 207, 19-27 (1980).</li><li>Zhang, M., Tanaka, T., Ikura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+conformational+transition+revealed+by+the+solution+structure+of+apo+calmodulin.">Calcium-induced conformational transition revealed by the solution structure of apo calmodulin.</a> Nat. Struct. Biol. 2, 758-767 (1995).</li><li>Alexander, K. A., Wakim, B. T., Doyle, G. S., Walsh, K. A., Storm, D. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+myosin+light+chain+kinase+requires+the+calcium-binding+protein+calmodulin+for+activity.">Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1653-1657 (1979).</li><li>Fukunaga, K., Yamamoto, H., Matsui, K., Higashi, K., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+Ca2+-+and+calmodulin-dependent+protein+kinase+from+rat+brain.">Purification and characterization of a Ca2+- and calmodulin-dependent protein kinase from rat brain.</a> J. Neurochem. 39, 1607-1617 (1982).</li><li>Yang, S. D., Tallant, E. A., Cheung, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcineurin+is+a+calmodulin-dependent+protein+phosphatase.">Calcineurin is a calmodulin-dependent protein phosphatase.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 106, 1419-1425 (1982).</li><li>Huestis, W. H., Nelson, M. J., Ferrell, J. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin-dependent+spectrin+kinase+activity+in+human+erythrocytes.">Calmodulin-dependent spectrin kinase activity in human erythrocytes.</a> Prog. Clin. Biol. Res. 56, 137-155 (1981).</li><li>Yamniuk, A. P., Vogel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin's+flexibility+allows+for+promiscuity+in+its+interactions+with+target+proteins+and+peptides.">Calmodulin's flexibility allows for promiscuity in its interactions with target proteins and peptides.</a> Mol. Biotechnol. 27, 33-57 (2004).</li><li>Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogranin+phosphorylation+fine-tunes+long-term+potentiation.">Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation.</a> Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo fornito utilizza CaM-sefarosio perline per indagare il Ca 2 +-dipendenza di CaM proteine ​​leganti. Molte proteine ​​si legano CaM in Ca 2 +-dipendente. Queste interazioni sono di grande importanza dato il numero di proteine ​​che legano CaM e il loro ruolo fondamentale in molte vie di segnalazione. In questo protocollo, Cam-sefarosio perline vengono utilizzate per separare CaM-binding proteins da tessuto omogenato in presenza o in assenza di Ca 2 +. I risultati...

<table border="1"><tr><td> Prodotto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Note </td></tr><tr><td> Calmodulina-Sepharose perline </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0529-01 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-alfa CaMKII </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6974 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-neurogranin </td><td> Millipore </td><td> 07-425 </td><td></td></tr><tr><td> Gel Loading Pipettare Consigli </td><td> Pescatore </td><td> 02-707-138 </td><td> L&#39;uso per l&#39;aspirazione di surnatanti </td></tr><tr><td> Microprovette (2,0 ml) </td><td> Pescatore </td><td> 05-408-146 </td><td> Utilizzare per tutte le fasi che coinvolgono calmodulina-sefarosio perline </td></tr></table>

pull-down of calmodulin-binding proteins

Calcio (Ca 2 +) è uno ione fondamentale nella regolazione della funzione cellulare attraverso una varietà di meccanismi. Gran parte del Ca 2 + segnalazione è mediato attraverso la proteina legante il calcio conosciuto come calmodulina (CaM) 1,2. CaM è coinvolta a più livelli in quasi tutti i processi cellulari, tra cui l&#39;apoptosi, il metabolismo, la contrazione della muscolatura liscia, la plasticità sinaptica, la crescita dei nervi, l&#39;infiammazione e la risposta immunitaria. Un certo numero di proteine ​​aiutano a regolare queste vie attraverso la loro interazione con la CaM. Molte di queste interazioni dipende dalla conformazione della CAM, che è nettamente diverso quando si lega al Ca 2 + (Ca 2 +-Cam), in opposizione alla sua Ca 2 + libero stato (ApoCaM) 3. Mentre la maggior parte delle proteine ​​bersaglio legano Ca 2 +-CAM, solo alcune proteine ​​si legano ai ApoCaM. Alcuni CaM si legano attraverso il loro IQ-dominio, tra cui neuromodulin 4, neurogranin (Ng) 5, e alcuni miosine <sup&gt; 6. Queste proteine ​​hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella funzione presinaptica 7, funzione post-sinaptici 8, e la contrazione muscolare 9, rispettivamente. La loro capacità di legare e rilasciare CaM in assenza o in presenza di Ca 2 + è fondamentale nella loro funzione. Al contrario, molte proteine ​​si legano solo Ca 2 +-CAM e necessitano di questo legame per la loro attivazione. Gli esempi includono miosina chinasi della catena leggera 10, Ca 2 + / CaM chinasi-dipendenti (CaMKs) 11 e fosfatasi (ad esempio calcineurina) 12, e spettrina chinasi 13, che hanno una varietà di effetti diretti ed a valle 14. Gli effetti di queste proteine ​​sulla funzione cellulare dipendono spesso dalla loro capacità di legarsi al CaM in Ca 2 +-dipendente. Per esempio, abbiamo testato la rilevanza di Ng-CAM obbligatorio in funzione sinaptica e di come diverse mutazioni influenzano questa associazione. Abbiamo generato un GFP-tagged con Ngstruct con mutazioni specifiche nel IQ-dominio che avrebbe cambiato la capacità di Ng di legare CaM in Ca 2 +-dipendente. Lo studio di queste mutazioni diverse ci ha dato grande intuizione in importanti processi coinvolti nella funzione sinaptica 8,15. Tuttavia, in tali studi, è essenziale per dimostrare che le proteine ​​mutate hanno atteso il legame alterato per CAM. Qui vi presentiamo un metodo per testare la capacità delle proteine ​​di legarsi al CaM in presenza o in assenza di Ca 2 +, con CaMKII e Ng come esempi. Questo metodo è una forma di cromatografia di affinità indicato come un pull-down assay CaM. Utilizza CaM-Sepharose perline per testare le proteine ​​che si legano CaM e l&#39;influenza di Ca 2 + su questa associazione. E &#39;molto più tempo efficiente e richiede meno proteine ​​rispetto alla cromatografia su colonna, ed altri test. Complessivamente, questo fornisce un valido strumento per esplorare Ca 2 + / CaM e proteine ​​di segnalazione che interact con CaM.

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Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calmodulina (CaM) pull-down saggio è un modo efficace per studiare l&#39;interazione del CAM con varie proteine. Questo metodo utilizza CaM-sefarosio perle per l&#39;analisi efficiente e specifica di CaM proteine ​​leganti. Questo fornisce un importante strumento per esplorare segnalazione CaM in funzione cellulare.

Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

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JoVE Journal

Biology

25.3K Views.  Medical College of Wisconsin. Calmodulina (CaM) pull-down saggio è un modo efficace per studiare l'interazione del CAM con varie proteine. Questo metodo utilizza CaM-sefarosio perle per l'analisi efficiente e specifica di CaM proteine ​​leganti. Questo fornisce un importante strumento per esplorare segnalazione CaM in funzione cellulare.

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Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

Separazione elettroforetica delle proteine

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

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Biologia

Staining Proteins in Gels

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for detecting proteins by four popular methods. Coomassie blue staining is an easy and rapid method. Silver staining, while more time consuming, is considerably more sensitive and can thus be used to detect smaller amounts of protein. Fluorescent staining is a popular alternative to traditional staining procedures, mainly because it is more sensitive than Coomassie staining, and is often as sensitive as silver staining. Staining of proteins with SYPRO Orange and SYPRO Ruby are also demonstrated here.

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. Staining of proteins with Coomassie Blue, Silver Staining, SYPRO Orange, SYPRO Ruby are demonstrated in this video.

Colorazione proteine ​​in gel

Following separation by electrophoretic methods, proteins in a gel can be detected by several staining methods. This unit describes protocols for ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Stampa microcontatto di proteine ​​per Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

High-throughput Purificazione di affinità-tagged proteine ​​ricombinanti

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past years, hydrodynamic gene delivery (HGD) has emerged as a simple, fast, safe and effective method for delivering transgenes into rodents. This technique relies on the force generated by the rapid injection of a large volume of physiological solution to increase the permeability of cell membranes of perfused organs and thus deliver DNA into cells. One of the main advantages of HGD is the ability to introduce transgenes into mammalian cells using naked plasmid DNA (pDNA). Introducing an exogenous gene using a plasmid is minimally laborious, highly efficient and, contrary to viral carriers, remarkably safe. HGD was initially used to deliver genes into mice, it is now used to deliver a wide range of substances, including oligonucleotides, artificial chromosomes, RNA, proteins and small molecules into mice, rats and, to a limited degree, other animals. This protocol describes HGD in mice and focuses on three key aspects of the method that are critical to performing the procedure successfully: correct insertion of the needle into the vein, the volume of injection and the speed of delivery. Examples are given to show the application of this method to the transient expression of two genes that encode secreted, primate-specific proteins, apolipoprotein L-I (APOL-I) and haptoglobin-related protein (HPR).

In vivo transfection of naked DNA by hydrodynamic gene delivery introduces genes into the tissue of an animal with minimal inflammatory response. Sufficient amounts of gene product are generated such that gene function and regulation as well as protein structure and function can be analyzed.

Espressione transiente di proteine ​​da parte idrodinamica Gene Consegna in topi

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

Pull-down di Calmodulina proteine ​​leganti

Pull-down di Calmodulina proteine leganti