L'assorbimento e il metabolismo degli aminoacidi sono essenziali per la specificazione, la differenziazione e la formazione ossea degli osteoblasti. Questo protocollo fornisce un metodo rapido e sensibile per valutare l'assorbimento di aminoacidi. Il nostro protocollo utilizza aminoacidi radiomarcati per quantificare l'assorbimento di aminoacidi.
È un metodo economico, sensibile e veloce che può essere facilmente modificato per diverse condizioni. Questo protocollo può essere facilmente modificato per valutare l'assorbimento di altri nutrienti radiomarcati come glucosio e acidi grassi in una varietà di tessuti e cellule primarie o trasformate. Per iniziare la piastra di saggio di assorbimento degli aminoacidi cinque volte 10 alle quarte cellule ST2 in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti in mezzo alfa MEM integrato con FBS, penicillina e streptomicina.
Piastra extra pozzetti di cellule per quantificare il numero di celle per condizione per le normalizzazioni. Successivamente, incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare umidificata a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due o tre giorni fino al confluente. Dopo l'incubazione aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS a pH 7,4.
Quindi aspirare il PBS prima di lavare le cellule una volta con un millilitro di Krebs-Ringer HEPES o KRH. Incubare le cellule con 0,5 millilitri di KRH appena preparato contenente quattro microcurie per millilitro di glutammina triziata L34 per cinque minuti. Dopo l'incubazione, raccogliere il mezzo radioattivo da erogare nel contenitore dei rifiuti liquidi.
Quindi lavare le cellule tre volte con KRH ghiacciato per terminare la reazione. Quindi, aggiungere un millilitro di 1% di sodio dodecilsolfato a ciascun pozzetto e triturare la miscela 10 volte per lisare e omogeneizzare le cellule. Quindi trasferire i lisati cellulari in un tubo da 1,5 millilitri e chiarire il lisato centrifugando ad una velocità minima di 10.000 G per 10 minuti.
Trasferire il surnatante in un flaconcino di scintillazione contenente otto millilitri della soluzione di scintillazione e leggere l'attività radio e i conteggi al minuto utilizzando il contatore di scintillazione. Dalle restanti piastre non radioattive di cellule, tripsinizzare, risospendere e contare le cellule per stimare il numero di cellule nelle colture radioattive lisate. Utilizzando un ematocitometro, contare il numero di cellule per pozzo non radioattivo per ogni condizione sperimentale.
Per determinare l'assorbimento di aminoacidi, scovare il midollo dall'osso prima di pesare l'albero osseo. Per decellularizzare l'osso, far bollire un omero in PBS a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Equilibrare sia l'humeri vivo che quello bollito in un millilitro di KRH per 30 minuti nell'incubatore di coltura cellulare a 37 gradi Celsius.
Successivamente, incubare separatamente le ossa di controllo sperimentali e bollite in KRH appena preparato contenente quattro microcurry per millilitro di arginina tricizzata L234 per un massimo di 90 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il mezzo radioattivo, terminare la reazione lavando l'omero tre volte con un millilitro di KRH ghiacciato. Trasferire ogni osso in un tubo da 1,5 millilitri con 500 microlitri di tampone RIPA.
Quindi omogeneizzare l'omero e il tampone RIPA tagliando 100 volte con le forbici, seguito da sonicazione al 35% di ampiezza e un secondo impulso per 10 secondi. Chiarificato il lisato mediante centrifugazione per 10 minuti a 10.000 volte G a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, trasferire 200 microlitri di surnatante in flaconcini di scintillazione contenenti otto millilitri della soluzione di scintillazione.
Leggere l'attività radio utilizzando il contatore di scintillazione. Le proprietà cinetiche dell'assorbimento triziato di glutammina L34 in vitro e delle cellule ST2 confluenti sono state valutate in presenza o assenza di acido isobutirrico metilamminico di sodio o litio. La rimozione del sodio ha portato ad una riduzione del 90% dell'assorbimento di glutammina.
La presenza di litio ha aumentato l'assorbimento di glutammina del 2% rispetto alla condizione priva di sodio. Mentre l'acido metil amminoisobuttrico non ha influenzato l'assorbimento di glutammina. I contributi percentuali stimati del sistema A, N, L o ASC e gamma più L hanno indicato che la maggior parte dell'assorbimento di glutammina è mediato dai sistemi ASC e gamma più L.Il sistema N è responsabile di circa il 2% di assorbimento di glutammina dipendente dal sodio.
E il sistema A ha mostrato lo 0% di contributo e assorbimento. L'assorbimento tritiato di arginina X-VIVO L34 nell'omeri neonatale bollito e vivo è stato analizzato nel corso di due ore. L'assorbimento di arginina è aumentato linearmente durante l'esperimento e gli omeri vivi.
L'humeri bollito non ha mostrato un aumento dinamico dell'assorbimento di arginina nell'esperimento. L'analisi rappresentativa mostra l'assorbimento normalizzato e corretto di arginina. È importante far bollire l'osso controlaterale come controllo attivo.
Questo passaggio è essenziale in quanto la matrice ossea può assorbire amminoacidi radioattivi, con risultati imprecisi. Il protocollo ha permesso di confermare la cinetica di assorbimento degli aminoacidi sia in vitro che in vivo.
